生化實(shí)驗(yàn)過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定傅璐1211400122013/11/28過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定傅璐121140012一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解米氏常數(shù)的測(cè)定方法2.學(xué)習(xí)提取生物組織中的酶二、實(shí)驗(yàn)原理米氏反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏方程(Michaelis-MentenEquation):米氏常數(shù)的意義：反映酶的種類：Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)，與酶濃度、底物濃度無關(guān)。米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax一半時(shí)的底物濃度。其數(shù)值大小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之Km值越小，親和能力越強(qiáng)。Km可用來判斷酶（多功能酶）的最適底物：Km值最小的酶促反應(yīng)對(duì)應(yīng)底物就是該酶的最適底物。3.米氏常數(shù)的求法：該方法的缺點(diǎn)是難以確定最大反應(yīng)速度Vmax。該方法的缺點(diǎn)是難以確定最大反應(yīng)速度Vmax。該作圖法應(yīng)用最廣。但在低濃度是v值誤差較大，在[S]等差值實(shí)驗(yàn)時(shí)作圖點(diǎn)較集中于縱軸。因此在設(shè)計(jì)底物濃度時(shí)，最好將1/[S]配成等差數(shù)列，這樣可使點(diǎn)距較為平均，再配以最小二乘回歸法，就可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。此法優(yōu)點(diǎn)是橫軸上點(diǎn)分布均勻，缺點(diǎn)是1/v會(huì)放大誤差，同時(shí)對(duì)底物濃度的選擇有要求。[S]<<Km時(shí)圖形近于水平線，[S]>>Km時(shí)直線將在原點(diǎn)附近與軸相交。4.氧化酶：生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內(nèi)自由基：①POD：過氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；過氧化氫酶5.過氧化氫酶的作用：植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過氧化氫發(fā)生積累。過氧化氫可進(jìn)行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強(qiáng)，可使細(xì)胞膜遭受損害，加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除過氧化氫、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活，因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。6.過氧化氫酶活力的測(cè)定方法：米氏常數(shù)Km=-0.1913七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：1.曲線上少一個(gè)點(diǎn)的原因：用移液管移取序號(hào)為2的過氧化氫溶液（應(yīng)為1.25ml）錯(cuò)誤的移取了1.75ml，故在制圖時(shí)將其舍去。2.曲線線性較好（R2=0.9988）的原因：本實(shí)驗(yàn)采取了兩人分工的方法完成實(shí)驗(yàn)，控制反應(yīng)結(jié)束及滴定分別由一人完成，所以標(biāo)準(zhǔn)都相同，從而在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。Km計(jì)算結(jié)果呈負(fù)值的原因：Km呈負(fù)值（即整條直線都向下移動(dòng)），亦即所有測(cè)定的v值都偏大。由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推斷最可能的原因是V