紫杉醇的生物合成紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第1頁。背景介紹

紫杉醇是目前臨床上最暢銷的抗惡性腫瘤藥物。其特點是廣譜抗癌?，F(xiàn)為治療卵巢癌和乳腺癌的一線藥物，對鉑類等已有抗藥性的頑固性卵巢癌亦有效。此外，紫杉醇對肺癌、食管癌、膀胱癌、頭頸部癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和HIV引起的卡波濟肉瘤也有效。

人們已在紫杉醇結(jié)構(gòu)基礎上進行側(cè)鏈改造，得到了多西紫杉。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第2頁。獲取紫杉醇的途徑化學合成紅豆杉中提取

植物細胞培養(yǎng)真菌發(fā)酵4123紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第3頁?；瘜W合成紫杉醇分子結(jié)構(gòu)復雜，具有特殊的三環(huán)[6+8+6]碳架和橋頭雙鍵以及眾多的含氧取代基。先后共有30多個研究組參與研究其全合成，經(jīng)20多年的努力，于1994年才由的R．A．Holton與K．C．Nic~aou兩個研究組同時完成紫杉醇的全合成。隨后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和Kuwajima(1998年)4個研究組也完成這一工作。半合成方法一般以其前體10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ為原料，延長邊鏈而成。另一種半合成方法是以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ為前體物來合成。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第4頁?；瘜W合成的缺陷合成路線復雜，反應條件難以控制，產(chǎn)率低。用到了劇毒的原料，僅限于實驗室水平，很難進行工業(yè)化生產(chǎn)。

半合成中的前體脫乙?；鶟{果赤霉素仍是從紅豆杉中提取。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第5頁。從紅豆杉中提取紫杉醇在植物體內(nèi)的含量相當?shù)停壳肮J含量最高的短葉紅豆杉樹皮中也僅含0．069％資源很匱乏紅豆杉生長緩慢，樹皮剝?nèi)ズ蟛荒茉偕瑯淠緦⑺劳鲎仙即嫉纳锖铣扇墓?7頁，當前為第6頁。紅豆杉懷璧獲罪由于、加拿大等國家對紅豆杉立法保護，藥源地轉(zhuǎn)向了中國等

國家。在中國，８０％的紅豆杉集中在云南，而且云南紅豆杉的紫杉醇含量

最高。

１９９３年，民營企業(yè)云南漢德公司成立，其主要業(yè)務是從紅豆杉中提

取紫杉醇。１９９５年，漢德公司依靠中科院昆明植物研究所的技術(shù)，建成

了中國最大的年生產(chǎn)能力５０公斤的紫杉醇及其系列產(chǎn)品生產(chǎn)線。１９９９

年２月，該廠的產(chǎn)品還通過了ＦＤＡ認證，“順利掃清了通向市場

的障礙”。

云南省人民政府生物資源開發(fā)創(chuàng)新辦公室的資料說，漢德公司的紫杉醇

年出口量為２０—３０公斤（１公斤紫杉醇需用樹皮１５—３０噸）。目前

，中美合資的漢德生物技術(shù)開發(fā)已被云南省列為生物資源開發(fā)、出

口創(chuàng)匯的骨干企業(yè)，備受各方重視。２０００年底，該公司與簽訂了價

值６億多元的供貨合同。

在中國，獲得紫杉醇產(chǎn)品開發(fā)權(quán)的還有北京協(xié)和制藥廠。從1992年到2001年，將近10年時間，云南紅豆杉遭到了毀滅性的破壞，分布在滇西橫斷山區(qū)中的300多萬棵紅豆杉，絕大部分被剝了皮（有調(diào)查數(shù)據(jù)認為是92.5%），現(xiàn)正在慢慢死去。

紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第7頁。植物細胞培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織的繼代培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)細胞大量培養(yǎng)4123紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第8頁。工藝過程紅豆杉外植體的處理：用自來水充分洗凈，再用70%乙醇沖洗表面后切成小塊，在70%乙醇中浸泡2分鐘，再轉(zhuǎn)移至0.1%升汞溶液中浸泡20分鐘，然后用無菌水沖洗4到5次，備用。愈傷組織誘導及培養(yǎng)：將上述無菌紅豆杉嫩莖小塊組織接種于含2ppm的2，4-D、的KT及10%椰乳的MS培養(yǎng)基中，于25攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天，PH5.8,即可形成小的愈傷組織塊，然后每隔30天進行一次移植繼代培養(yǎng)。每次移植繼代培養(yǎng)均取一塊愈傷組織，不另其混雜，如此多次移植繼代培養(yǎng)即可獲得多個愈傷組織無性系。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第9頁。工藝過程細胞懸浮培養(yǎng)：培養(yǎng)基為含1ppm的2，4-D、的KT及10%椰乳的B-5培養(yǎng)基紅豆杉細胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細胞培養(yǎng)基相同。在反應器中加入培養(yǎng)液，滅菌后冷卻至室溫，接種已經(jīng)培養(yǎng)30天的懸浮培養(yǎng)細胞，接種量按干細胞1到2克每升，在25攝氏度下，培養(yǎng)30天，待收獲細胞。細胞干燥及收集：每批細胞培養(yǎng)30天后，離心或過濾收集細胞，用去離子水洗滌兩到三次，每次抽干，然后于30至40攝氏度低溫下真空凍干，即得紅豆杉培養(yǎng)細胞成品。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第10頁。分離純化1.超臨界提取,然后經(jīng)己烷脫脂,氯仿萃取3.梯度洗脫紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第11頁。真菌發(fā)酵發(fā)現(xiàn)：1993年，蒙大拿州立大學的植物病理學家Strobel和化學家Stierle在短葉紅豆杉的韌皮部中發(fā)現(xiàn)了一種內(nèi)生真菌，它能夠自主產(chǎn)生紫杉醇。1996年，從西藏紅豆杉小枝的內(nèi)皮層中分離得到的內(nèi)生小孢擬盤多毛孢，實驗證明它能產(chǎn)生紫杉醇。后來，人們發(fā)現(xiàn)從南卡羅來納州柏樹的樹皮中獲得的小孢擬盤多毛孢、一種土生茜草科植物中分離得到的內(nèi)生真菌也能產(chǎn)生紫杉醇我國科研工作者在東北紅豆杉、南方紅豆杉、云南紅豆杉中均找到產(chǎn)紫杉醇的真菌但問題是：這些菌株的產(chǎn)量實在太低……紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第12頁。菌株的改良基因工程技術(shù)利用雙親滅活原生質(zhì)體融合利用原生質(zhì)體誘變用紫外線等誘變紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第13頁。內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢生產(chǎn)的可重復性，在工業(yè)上可用發(fā)酵罐大規(guī)模進行生產(chǎn)，內(nèi)生真菌生長迅速，易于培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短。微生物能在簡單的培養(yǎng)基上生長，應用的培養(yǎng)基相對比較便宜，在收集紫杉酵之前，可以通過改良培養(yǎng)環(huán)境、改進技術(shù)來提高產(chǎn)量。微生物育種和選育速度會明顯高于植物細胞株。增加微生物的生產(chǎn)能力比較容易，微生物易于通過基因工程等方法篩選高產(chǎn)菌株，提高紫杉醇的產(chǎn)量。藥廠利用微生物規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)的技術(shù)比較成熟，其培養(yǎng)與發(fā)酵條件相對易于控制和掌握，即微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的轉(zhuǎn)產(chǎn)風險明顯小于細胞培養(yǎng)法與化學合成法。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第14頁。利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)紅豆杉的過程內(nèi)生真菌培養(yǎng)紫杉醇的分離52341內(nèi)生真菌的分離紫杉醇的檢測紫杉醇的純化紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第15頁。內(nèi)生真菌的分離將植物材料用70％酒精進行表面徹底消毒，風干后，用無菌刀片切除外部組織，將修整好的內(nèi)部組織放在水瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，真菌便生長出來。然后，將分離出的內(nèi)生真菌菌絲尖端轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，室溫培養(yǎng)至少10d，檢查真菌培養(yǎng)平板，不斷純化，最終獲得純種的內(nèi)生真菌，同時立即放入含15％甘油中，-70℃保存，以備發(fā)酵使用。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第16頁。內(nèi)生真菌培養(yǎng)內(nèi)生真菌在PDA瓊脂培養(yǎng)基中不易產(chǎn)生孢子，因此，需將真菌接種在水瓊脂培養(yǎng)基中的香石林葉片上，23℃，1至2周后即可出現(xiàn)暗色的成熟孢子。然后，將含菌絲體的瓊脂塊接種在2L錐形燒瓶(含500mLPDA培養(yǎng)基)中，23℃培養(yǎng)。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第17頁。紫杉醇的分離培養(yǎng)一段時間后，將全部培養(yǎng)物過濾(為了降低可能污染紫杉醇的脂肪酸含量，可在搖瓶中添加適量的碳酸鈉)，培養(yǎng)液用等體積的次氯酸提取，有機相35℃減壓蒸干，殘余物再用次氯酸鹽溶解，硅膠柱進行階段洗脫。紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第18頁。TLCHPLC質(zhì)譜免疫檢測紫杉醇的檢測紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第19頁。硅膠氧化鋁柱色譜制備型HPLC高速逆流色譜(HSCCC)：采用4個成分(正已烷一乙酸乙酯一乙醇一水)雙相溶劑系統(tǒng)，通過兩步即完成分離，產(chǎn)物純度可達85％----95％。紫杉醇的純化紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第20頁。添加合成紫杉醇的前體物添加代謝產(chǎn)物合成抑制劑尋找特殊的真菌調(diào)節(jié)劑提高真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量！構(gòu)建基因工程菌紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第21頁。植物和真菌合成紫杉醇的途徑不盡相同，不同真菌合成的前提也不盡相同。紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自經(jīng)甲基戊酸，乙?；鶃碜砸宜幔鳦13位酯基側(cè)鏈來自苯丙氨酸，因此向培養(yǎng)基中加入甲基戊酸、乙酸鈉、苯丙氨酸可以可以提高紫杉醇產(chǎn)量。文獻報道還有人用苯甲酸鈉和鄰苯二酚。添加合成紫杉醇的前體物紫杉醇的生物合成全文共27頁，當前為第22頁。將植物材料用70％酒精進行表面徹底消毒，風干后，用無菌刀片切除外部組織，將修整好的內(nèi)部組織放在水瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，真菌便生長出來。用到了劇毒的原料，僅限于實驗室水平，很難進行工業(yè)化生產(chǎn)。紫杉醇是目前臨床上最暢銷的抗惡性腫瘤藥物。紅豆杉外植體的處理：用自來水充分洗凈，再用70%乙醇沖洗表面后切成小塊，在70%乙醇中浸泡2分鐘，再轉(zhuǎn)移至0.另一種半合成方法是以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ為前體物來合成。高速逆流色譜(HSCCC)：采用4個成增加微生物的生產(chǎn)能力比較容易，微生物易于通過基因工程等方法篩選高產(chǎn)菌株，提高紫杉醇的產(chǎn)量。紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自經(jīng)甲基戊酸，乙?；鶃碜砸宜幔鳦13位酯基側(cè)鏈來自苯丙氨酸，因此向培養(yǎng)基中加入甲基戊酸、乙酸鈉、苯丙氨酸可以可以提高紫杉醇產(chǎn)量。紫杉醇分子結(jié)構(gòu)復雜，具有特殊的三環(huán)[6+8+6]碳架和橋頭雙鍵以及眾多的含氧取代基。用到了劇毒的原料，僅限于實驗室水平，很難進行工業(yè)化生產(chǎn)。微生物能在簡單的培養(yǎng)基上生長，應用的培養(yǎng)基相對比較便宜，在收集紫杉酵之前，可以通過改良培養(yǎng)環(huán)境、改進技術(shù)來提高產(chǎn)量。紫杉醇在植物體內(nèi)的含量相當?shù)停壳肮J含量最高的短葉紅豆杉樹皮中也僅含0．069％２０００年底，該公司與簽訂了價

值６億多元的供貨合同。然后，將分離出的內(nèi)生真菌菌絲尖端轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，室溫培養(yǎng)至少10d，檢查真菌培養(yǎng)平板，不斷純化，最終獲得純種的內(nèi)生真菌，同時立即放入含15％甘油中，-70℃保存，以備發(fā)酵使用。5%），現(xiàn)正在慢慢死去。愈傷組織誘導及培養(yǎng)：將上述無菌紅豆杉嫩莖小塊組織接種于含2ppm的2，4-D、的KT及10%椰乳的MS培養(yǎng)基中，于25攝氏度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天，PH5.其特點是廣譜抗癌。隨后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和Kuwajima(1998年)4個研究組也完成這一工作。紅豆杉細胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細胞培養(yǎng)基相同。隨著對紫杉醇產(chǎn)生菌的生物合成過程更深入的闡明及相關(guān)酶基因的克隆與表達，對其進行基因改造，構(gòu)建高產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌的工程菌株，可以提高紫杉醇的產(chǎn)量。從1992年到2001年，將近10年時間，云南紅豆杉遭到了毀滅性的破壞，分布在滇西橫斷山區(qū)中的300多萬棵紅豆杉，絕大部分被剝了皮（有調(diào)查數(shù)據(jù)認為是92.由于、加拿大等國家對紅豆杉立法保護，藥源地轉(zhuǎn)向了中國等

國家。隨后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和Kuwajima(1998年)4個研究組也完成這一工作。在中國，獲得紫杉醇產(chǎn)品開發(fā)權(quán)的還有北京協(xié)和制藥廠。培養(yǎng)一段時間后，將全部培養(yǎng)物過濾(為了降低可能污染紫杉醇的脂肪酸含量，可在搖瓶中添加適量的碳酸鈉)，培養(yǎng)液用等體積的次氯酸提取，有機相35℃減壓蒸干，殘余物再用次氯酸鹽溶解，硅膠柱進行階段洗脫。先后共有30多個研究組參與研究其全合成，經(jīng)20多年的努力，于1994年才由的R．A．Holton與K．C．Nic~aou兩個研究組同時完成紫杉醇的全合成。在許多微生物與植物的互作體系中，宿主植物中某些極微量的化合物對微生物產(chǎn)生目的產(chǎn)物是必不可少的，它可啟動微生物中的某些遺傳功能，從而促進某些產(chǎn)物的合成。紫杉醇的三環(huán)二萜骨架來自經(jīng)甲基戊酸，乙?；鶃碜砸宜?，而C13位酯基側(cè)鏈來自苯丙氨酸，因此向培養(yǎng)基中加入甲基戊酸、乙酸鈉、苯丙氨酸可以可以提高紫杉醇產(chǎn)量。紫杉醇在植物體內(nèi)的含量相當?shù)?，目前公認含量最高的短葉紅豆杉樹皮中也僅含0．069％由于、加拿大等國家對紅豆杉