ernBlot一、原理用于蛋白質(zhì)的固定和分析，分離蛋白質(zhì)，相對檢測蛋白含量。將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成份保留抗原活性及與其它生物大分子特異性結(jié)合的能力，所以能與特異的抗體或核酸結(jié)合。第一抗體與特異性抗原決定族結(jié)合，再用經(jīng)標(biāo)記(用同位素或非同位素)的第二抗體來測檢。不同的蛋白質(zhì)具有不同的分子量，并在一定的溶液中帶有不同的電荷。但經(jīng)過陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉()處理后的蛋白質(zhì)，分子表面完全被負(fù)電荷所覆蓋，因此在電泳時，電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子量大小而與其所帶電荷性質(zhì)無關(guān)。聚丙烯酸胺凝膠電泳是由丙烯酸胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酸胺在催化劑作用下，形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在不連續(xù)聚丙烯酸胺凝膠電泳中，凝膠的制作是分層進行的，因此凝膠不僅具有分子篩作用，還具有濃縮效應(yīng)。由于不連續(xù)梯度作用，樣品被壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。另外采用考馬斯亮藍快速染色，可及時觀察電泳結(jié)果，從而推算樣品中蛋白質(zhì)的分子量。由于凝膠易碎，易擴散，很難對它們進行各種處理以檢測出我們感興趣的特異性譜帶。因此，在上述實驗的基礎(chǔ)上，采用蛋白印跡技術(shù)把凝膠電泳已分離的分子區(qū)帶轉(zhuǎn)移并固定到一種特殊的載體上，使之形成經(jīng)得起各種處理及容易和各自的特異性配體結(jié)合的穩(wěn)定分子，以便進一步分析體反應(yīng)等三大實驗部分組成。經(jīng)－分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，能保證電泳分離的物質(zhì)的類型及其生物學(xué)活性不變，以固相載體上的蛋白清或多肽作為抗原．與對應(yīng)的抗體起免疫應(yīng)應(yīng)．再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影即可檢查待測物質(zhì)的組分。二、蛋白提取細(xì)胞總提取分子量脫氧膽酸鈉，去污劑分子量可長期保存XgXg)裂解液磷酸酶抑制劑蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑：根據(jù)細(xì)胞密度的大小加將二種液體混合秒之內(nèi)用完。用預(yù)冷的洗次。將培養(yǎng)瓶斜放在冰上，用槍吸出殘留的。4用槍加裂解液橫掃用細(xì)胞刮用酒精棉擦凈刮掉細(xì)胞吸到管子里，冰上靜置1。離心，1g15’4℃提前預(yù)熱離心機。組織總蛋白提取→自來沖洗→洗滌劑煮煮沸→5甘油調(diào)值，先定溶，后調(diào)。1514.5555g分子量1211g1先定容，后調(diào)值g1帶面罩配，無需滅菌，室溫保存，加熱至℃助溶。步驟：1液氮中碾碎組織，將樣本1倒g入含1的管中(1ml/100mg組織)。勻漿器勻漿次1秒，使樣本完全均勻，所有樣本在冰上。樣本放在冰上至少1。4超聲振蕩次5秒(如需要，時間可更長)留上清(總蛋白在上清中)注：這些樣本可不用4×或×g因為中含除β和外的g所有成份。首先蛋白分析，取相同蛋白量＋β＋備：勻漿器、研缽、冰盒、、4℃離心機、液氮測蛋白含量作標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋樣品‰：①染液樣品②備一個(染液)比色杯：乙醇洗，自來水，三蒸水，濃鹽酸過夜，三蒸水沖，無水乙醇備用。次。法測定蛋白濃度考馬斯亮藍有紅，藍兩種不同的著色形式，在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)混合物在處有最大光吸收值，化合物深淺與蛋白濃度的高低成正比。優(yōu)點是反應(yīng)迅速而敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)的損失；缺點是對各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同會引起蛋白質(zhì)不可逆的變性。注意事項反應(yīng)后充分顯色，但后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白，在酸性條件下易發(fā)生沉淀。如果能在內(nèi)測完標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，顏色損失誤差將小于。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的已知蛋白一般為牛血清蛋白或卵白蛋白和待測蛋白溶液應(yīng)一起準(zhǔn)備且每一樣品應(yīng)做到次重復(fù)如果用同一比色杯測多個樣本濃度應(yīng)先測低蛋白濃度的樣品。每一次測定未知蛋白濃度時都要重新做一新的標(biāo)準(zhǔn)曲線：由于蛋白和染料形成復(fù)合物的反應(yīng)是連續(xù)進行的。工作液應(yīng)依次加入標(biāo)準(zhǔn)和未知蛋白溶液中，所有的樣品也應(yīng)按照反應(yīng)的次序依次測定。該法的靈敏度范圍：蛋白質(zhì)濃度的量該法所測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線在，最小測量體積，最小測量蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系，所以如果未知蛋白的光吸收值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之外，會產(chǎn)生很大的誤差。如果樣品的光吸收值超過了線性范圍，可用工作液稀釋樣本至后再測，空白對照也應(yīng)進行同樣體積的稀釋。璃比色杯可先用甲醇沖洗，然后用玻璃制品清潔劑洗滌，最后用水和丙酮沖洗，或者在濃鹽酸中浸泡過夜。上樣量的計算每加樣孔量：濃度高，用先用稀釋(×取稀釋后共濃度在，再加×三、試劑配制丙烯酰胺丙烯酰胺叉過硫酸銨()過硫酸銨μ過膜，或過濾紙去雜質(zhì)。℃加熱溶解，室溫避光保存，≤隔數(shù)月更換?！姹４鏀?shù)周，隔周重新配制。堿堿調(diào)至調(diào)至室溫保存分子量分子量×電泳緩沖液℃保存，用時稀釋為×甘氨酸小蛋白大蛋白轉(zhuǎn)膜液大用低濃度的膠小用高濃度的膠甘氨酸甘氨酸甲醇現(xiàn)用現(xiàn)配其余可儲存℃保存。用時現(xiàn)配封閉劑脫質(zhì)奶粉考馬斯亮藍染液考馬斯亮藍蒸餾水冰醋酸考馬斯亮藍脫色液蒸餾水冰醋酸×℃保存數(shù)周，或℃保存數(shù)月。甘油β巰基乙醇溴酚藍溴酚藍溴酚藍攪拌至完全溶解，過濾除去聚合染利春紅麗春紅三氯乙酸磺基水楊酸定影液麗春紅℃存可回收麗麗春紅顯影液檢測試劑：彩色高壓滅菌四、步驟刷玻片、白板、膠槽與膠接觸面一定要干凈，不干凈的地方用酒精棉擦干。洗滌劑→自來水→一蒸→三蒸→晾干將蛋白膠板裝好字在后短在前低可墊少許濾紙先用水試一下漏不漏，再用吸紙吸出。 制分離膠(根據(jù)片段大小配制)溶液成分不同體積()凝膠中各成分所需體積(溶液成分 水丙烯酰胺過硫酸按水丙烯酰胺過硫酸按水丙烯酰胺過硫酸按混勻后快速將分離膠灌人兩玻璃夾縫中至距梳齒下緣(或多一些)并小心在膠面上加入蒸餾水使其不產(chǎn)生氣泡在膠面上加入蒸餾水—稱水封，其目的是保持膠面平整和防止空氣進入，影響膠凝聚，自然凝聚約，傾斜倒出蒸餾水，用濾紙吸干。制積層膠()不同體積()凝膠中各成分所需體積()溶液成分水丙烯酰胺過硫酸按混勻后快速將積層膠倒入膠槽中盡量沒過玻璃板插入的梳子室溫放置?？捎帽ｕr膜封好，放℃?zhèn)溆?。變性，的管子，樣品＋樣體積的4×，混勻，封口膜封口，煮沸后放入冰盒內(nèi)，瞬時離心，準(zhǔn)備跑電泳。安裝電泳裝置短板向里白板字正面，筆做膠分界線記號，將×電泳泳槽中，不過線，拔出梳子，用注射器加×電泳沖洗上樣孔。倒入電樣品加入上樣孔其余上樣孔可加入跑膠，開始在積層膠時，前蘭完全跑到下緣(對著跑膠，開始在積層膠時，前蘭完全跑到下緣(對著配×轉(zhuǎn)膜，最后加入甲醇，將纖維、濾紙、轉(zhuǎn)子浸泡到。跑電泳外槽×電泳將電泳槽分離膠后為的大平皿中。將為~體積將裝好正負(fù)極對好，膜先在小平皿的甲醇中浸泡秒、再到水中浸泡，最后在中浸泡。將凝膠取下用膠鏟剪去積層膠只留分離膠浸泡在×中。如果不做蛋白印跡，則將分離膠用考馬斯亮藍染色液染色，用脫色液脫色過夜后，換保存液保存膠。此時可得到待測樣品的蛋白譜圖并計算每個蛋白成分的相對分子質(zhì)量。通常以相對遷移率來表示，其計算方法如下。用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及染料前沿與凝膠頂端的距離，按下式計算：樣品遷移距離(cm)aMr==染料遷移距離(cm)b以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對數(shù)對相對遷移率作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其。在黑色盒面上先放置纖維墊加濾紙b-染料遷移距離4-卵清蛋白5-牛血清蛋白張然后依次放上膠、膜加濾紙張纖維墊夾緊旋轉(zhuǎn)每一層都要趕盡氣泡使其全部浸泡在中趕出氣泡制成將置于轉(zhuǎn)膜盒中，白色對紅色，黑色對黑色，將盒中裝滿×放入冰盒、轉(zhuǎn)子在攪拌器上轉(zhuǎn)膜。恒流轉(zhuǎn)好，因為左右，室溫。洗膜，在雜交盒內(nèi)，放置在搖床上洗次，每次封閉，室溫封閉或封閉劑置雜交盒內(nèi)℃過夜。洗膜，在雜交盒內(nèi)，放置在搖床上洗膜，在雜交盒內(nèi)，放置在搖床上：一抗稀釋次，每次倍∶洗洗封閉封閉液封閉液，振蕩，室溫ββ雜一抗加入雜交盒內(nèi)，使膜泡在其中，室溫，搖床，搖1?；厥找豢辜佣梗瓜♂尅痢帘?，：一抗稀釋倍?！梅忾]封閉液封閉液，振蕩，室溫ββ將二抗加入雜交盒中，使膜泡在其中，室溫，搖床搖。盡量去除液體，放在(平穩(wěn)的保鮮膜上)雜交盒內(nèi)，正面向上(有面)，加入檢測劑(液各)均勻覆蓋膜正面，室溫避光。用保解膜將膜定好，正向上放在雜交夾中，膠布固定好，趕走氣泡，進入暗室。準(zhǔn)備好顯影液，定影液，鑷子，剪子。取一張膠片，緊貼在膜上，雜交夾壓緊，曝光。把膠片平放入顯影夜(保證片子平面同時浸入)數(shù)秒后，放入定影液沖洗，與膜上對照目的大小。注：先雜β，保證上樣量一致。膜的保存是晾干，浸在封閉液中再同時用泡好之后，洗膜，將膜上洗掉。轉(zhuǎn)膜后，需用麗春紅染色(：)稀釋，秒顯色，當(dāng)染色后各孔帶濃度一致時，可斷定加樣一致，可存圖留用，或可在同一膜上，用β雜，若條帶一致，則加樣一致?！呋饔?，不凝，加凝，最后加，凝膠時間盡量長?？梢淮尾橹箅x心，分裝℃保存，反復(fù)凍融次，冰上融。點雜交先算好濃度，體積，加共。煮樣先用甲醇過鈔，幾鈔，浸泡膜()晾干，也可℃烘干。膜分成等分。劃線，寫正面。將調(diào)至相同濃度(量)室溫封閉洗次加一抗(：洗次加二抗(：)室溫洗次跑膠后用考馬斯亮蘭染色，之后用去離子水沖干凈，加水至微波爐中，中高火加熱，直至顯帶，顯帶后結(jié)果不好①可能降解②染色時間過短，應(yīng)，或過液。特異性譜帶的檢出．非特異性蛋白染色為了檢查蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效果，對轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜可以用麗春紅染色，該染料可短暫顯紅色，而在水中(或在中)易于褪色，因此這種染色不影響后面抗原顯色反應(yīng)。印跡完畢，用鑷子小心取出膜，放置于塑料盒中。用麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果，用水輕輕漂洗數(shù)次至背景紅色消失。．特異性抗體檢測①用鑷子小心取出紙，放置小塑料盒中，加人封閉液，室溫振蕩以上。②倒出封閉液(置℃冰箱中，可重復(fù)使用)，加入用稀釋的第一抗體(按效價比例稀釋的小鼠腹水多克隆抗體)，在室溫下振搖過夜或至少。③用漂洗液洗次，每次(搖)。④加入用稀釋的酶標(biāo)二抗(按商品要求稀釋)，在室溫中不斷振搖，孵育。⑤同③，用漂洗液洗滌。⑥用顯色液(臨用前加)顯色，到顯色清晰時，用蒸餾水終止反應(yīng)。酚氯仿抽提法一、原理通過廣譜蛋白酶和表面活性劑消化、破碎細(xì)胞，然后用酚氯仿反復(fù)抽提變性并去除蛋白質(zhì)、脂類。最后用有機溶劑沉淀或用透析的方法收集。從不同組織或血中提取高質(zhì)量的是進行分子遺傳學(xué)各項研究的先決條件如重組技術(shù)，主要涉及如何從體內(nèi)中提取，在體外切割所需要的片段(目的基因)和選擇轉(zhuǎn)移目的基因的載體及對目的基因片段作選擇性擴增和表達檢測。制備高質(zhì)量的原則是提取和純化時，確保一級結(jié)構(gòu)(核苷酸序列)的完整性是最基本的要求(因為遺傳信息全部貯存在一級結(jié)構(gòu)內(nèi)，而其一級結(jié)構(gòu)還決定著高級結(jié)構(gòu)的形成及其與其它生物大分子的結(jié)合方式)。并要求將、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。輔乳動物的提取通常是在及一類的去污劑存在下，用蛋白酶消化，然后用酚、氯仿抽提實現(xiàn)的，即酚氯仿抽提法。用這一方法獲得的基因組大小約有，適用于分析和用λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫。二、總的原則盡量排除其它生物大分子和金屬離子。樣品中不應(yīng)含有對酶有抑制作用的有機溶劑和金屬離子。樣品中必須排除污染溶解，所以經(jīng)常用價或價陽離子結(jié)合，用有機溶劑(如乙醇、異丙醇、聚乙二醇等)來沉淀。用酶消化成短片以除去。糖類：動物少，一般不用特殊處理。植物有大量淀粉，需要處理。脂類：溶于有機溶劑相被去除。蛋白：常用有機溶劑變性法去除采用酚、氯仿反復(fù)抽提或用飽和鹽析沉淀蛋白質(zhì)。水無機鹽：沉淀后，通常采用乙醇水溶液洗滌沉淀次，以去除各種鹽類。三、蛋白變性與沉淀蛋白維持其溶解狀態(tài)的穩(wěn)定因素：水化膜，蛋白分子表面電荷。蛋白的變性，指蛋白在某些理化因素的作用下，其空間結(jié)構(gòu)(次級鍵，特別是氫鍵)受到破壞，從而改變其理化性質(zhì)，并失去其生物活性?；瘜W(xué)因素有強酸，強堿，乙醇，丙酮等有機溶劑，重金屬，生物堿試劑，尿素或胍等促溶劑，物理因素，如加熱、放射線、超聲波及震蕩等，變性后水化膜消失，使蛋白易于沉淀，其空間構(gòu)象改變，其活性喪失，蛋白變性并非絕對不可逆。蛋白的沉淀，能消除蛋白表面水化膜并中和其電荷的試劑均可引起的蛋白沉淀，中性鹽，有機溶劑，其些生物制劑，重分子酸類及重金屬鹽等。將大量中性鹽加到蛋白溶液中使蛋白沉淀析出方法為鹽析常用的中性鹽有硫酸銨和硫酸鈉。))將四、試劑配制()濃?乙酸鈉(三水乙酸鈉蛋白酶(蛋白酶滅菌提供反應(yīng)條件，℃保存。提供離子環(huán)境，增高滲透壓(()三羥甲基氨基甲烷弱堿性與形成緩沖溶液溶至，分裝后高壓滅菌。如溶液呈黃色，應(yīng)棄之。溶液值因溫度而異，溫度含酶，溶解，保存，去除分裝后高壓滅菌，室乙二銨四乙酸二鈉絡(luò)合劑緩沖液去除金屬離子絡(luò)合酶和微生物污染所必須的二價離子且須加入定溶須加入調(diào)至近時，才完全溶解?；钚詣ス竸┓肿拥氖杷伺c跨膜蛋白的跨膜疏水區(qū)結(jié)合，也與磷脂分子的疏水尾部結(jié)垢劑水溶性復(fù)合物進入溶液中，同時產(chǎn)垢劑也溶解磷脂。使脂類成乳濁液，溶解脂灶。加熱到℃，并用磁力攪拌器助溶，如需要，加幾滴濃調(diào)至，用水定溶至，室提高鹽使成鹽在無水乙醇中形成沉淀．用冰乙酸調(diào)值至，用水定溶至分裝小份，高壓滅菌。消化膜蛋白，組蛋白，使釋放出來冷凍保存℃無水乙醇洗去使樣中的無機鹽(將無機鹽溶解)鹽沉淀氯仿有機溶劑，使蛋白變性，去除殘存的酚氯仿不溶于水，酚溶于水，將酚抽提出來飽和酚(枸櫞酸鈉()限制性內(nèi)切酶)有機溶劑，溶解脂類與酚互溶，使蛋白變性沉淀抗凝，可用用肝素能抑制限制性內(nèi)切酶活性故一般不采用肝素抗凝是一種重組技術(shù)所需要的，是一類作用于雙鏈的，主要從細(xì)菌中提取，具有高度專一性，所謂專一性，就是指不同的內(nèi)切作用于不同的堿基序列，能在一定的位置上切斷生理鹽水稀釋作用，洗去表面粘液裂解液用三蒸水去離子水，低滲使脹裂破壞蛋白一級結(jié)構(gòu)，消化蛋白無酶的酶將胰酶酶溶于加熱緩慢冷卻至室溫分裝℃保存。提取液將凍存血液室溫融化，倒入離心管中，加入預(yù)冷生理鹽水倍體積(約)輕輕振蕩混勻(倒置)。如采集外周血加入抗凝。’離心(清洗細(xì)胞見圖)，倒掉上清，加入三蒸水，吹管吸勻輕輕振蕩至透明(倒置)，離心’(見圖)。加抽提液消化液加酶終濃度為℃水浴。黃色，透明為血清圖紅色，透明為破碎白色沉淀為未碎圖去除蛋白、多糖、脂類倒掉上清,加入ml/2ml,1去脂,Pr5消化白)。10m5冷卻至室溫，加等體積r飽和酚(有腐蝕性)(p)約相和酚相混勻成乳狀液。離心5000rpm’或rpm,15’。(見圖、如有必要再重復(fù)抽提步驟一次，5分鐘。m，輕輕混勻10m使水)將上層水相吸入另一個10m離心管中。加入酚、氯仿(體積比為1∶1)共m(與抽提液等體積)，輕輕混勻離心5000rpm’。抽提上層水相入另一個10m離心管中。加入氯仿(等體積)，輕輕混勻，離心5000rpm’。1抽提上層水相至三角錐瓶中。11先加入乙酸鈉(倍體積，滴，至終濃度為m)，再加入倍體積預(yù)冷的無水乙醇，搖動，可見白色絮裝析出(或看不見，可分裝離心或℃1h,℃過液，離心12000rpmm℃,5分,鐘。沉淀用乙醇洗兩次，空氣干燥)。1吸取到15m管中，加入5乙醇1m，℃1p1’洗出無機鹽。(圖5)1棄上清，室溫干燥(約分鐘，勿完全干燥)，適量加入5℃溶解。1室溫放置，使完全溶解于緩沖液(內(nèi)含，溶解起保存作用)后，℃保存。(若保存時間短，可用代替；時間長用，含酶，可用瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度，觀察其亮度)。約天才能完全溶解?！钣脵z測含量、純度此實驗用紫外分光光度法，結(jié)果分析因不同物質(zhì)含有不同基因，對不同波長的光有特異性吸收峰，如蛋白肽鍵、苯環(huán)對有特異吸收，而核酸中的堿基對光有特異性吸收。有蛋白、苯的污有蛋白、苯的污染有污染，為單鏈，空間構(gòu)象中有大量堿基暴露，此暴露的堿基對光強烈吸收一定要加夠的量，同時加熱攪伴，才能澄清?？雌胶夥邮欠窈?，可看顏色，呈清黃色，則值正確，可以用。酚、氯仿抽提：在等于或大于時，苯酚能夠溶解蛋白質(zhì)而不溶或難溶解。苯酚與抽提緩沖液互不相溶，脂類分子溶于下層有機相，溶于上層水相中。提高提取量及質(zhì)量：充分裂解消化(過夜消化后液體呈稀薄狀)。抽提混勻時輕柔翻轉(zhuǎn)離心管。離心后吸取上清注意不得攪動界面更不能吸入界面物質(zhì)。避免機械剪切致斷裂。的純度直接影響酶切效果：樣品純度差，常使酶切無法進行或酶解不完全，以致在后續(xù)的實驗中得出不準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。如提取試劑成分(酚、氯仿、乙醇、白沒去除干凈，這些物質(zhì)可以抑制限制性內(nèi)切酶活性。目標(biāo)以外的切酶非特異性結(jié)合，能降低酶的相對活性。等)殘留或細(xì)胞組分蛋或可以和限制性內(nèi)提取室溫融化胎血取，余℃保存，倒入離心管中，加倍體積()生理鹽水混勻。，，離心(離心機)。離心后發(fā)現(xiàn)溶血，管底有少量細(xì)胞沉積，棄上清，加上清，加入(的緩沖液)(變性)，(溶解細(xì)胞)混勻(振蕩)，℃水浴其余同上注：看平衡酚是否好，可看顏色，呈清黃色，則正確，可以用。離心機的使用方法：轉(zhuǎn)數(shù)×實際轉(zhuǎn)數(shù)，出現(xiàn)后，調(diào)時間小時：分鐘提取一、試劑配制裂解液()緩沖液()氯仿：異丙醇(：)二、步驟倒少許夜氮冷卻研缽的棒取組織，于研缽中剪碎，加液氮研磨至粉未狀。加細(xì)胞裂解液并將組織懸液吸入離心管中。加()終濃度。向離心管內(nèi)加等體積的飽和酚，輕輕混勻，至乳糜狀，離心吸上清至新離心管內(nèi)，重復(fù)步驟。吸上清至新離心管，加入等體積氯仿，輕輕混勻后離心，重復(fù)步驟吸上清至三解錐瓶中，加入倍體積的乙酸鈉()和輕輕晃動出現(xiàn)白色絮狀沉淀物，即為。。棄上清，室溫干燥至半透明加()℃保存。。。倍體積的無水乙醇，細(xì)胞組份的化學(xué)反應(yīng)一、存在部位的包括核內(nèi)和其中以上存在于核中，我們只考慮這部分。包括、、，主要參與蛋白合成，主要存在于質(zhì)中。核酸帶有弱堿性，帶有負(fù)電荷與堿性染料具有親和力。利用分子和分子的聚合程度的不同，對堿性染料有不同的親和力而進行選擇性染色。是由兩條多核苷酸鏈構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，表面帶負(fù)電荷，電荷密度大，甲基綠派洛寧溶液中的甲基綠分子帶有兩個正電荷，對聚合度高的分子有很強的親和力(圖)。則分子被染成藍色或綠色；而為單鏈結(jié)構(gòu)，也帶有負(fù)電荷，電荷密度小，派洛寧分子只有一個相對的正電荷，它和聚合程度低的分子結(jié)合(圖)，而將分子染成紫紅色。甲基綠也可以和結(jié)合，但結(jié)合后形成大卷曲(環(huán)狀結(jié)構(gòu)圖)，易被沖掉而被派洛寧替代；反應(yīng)對中的分子和分子進行定位、定性和定量分析。三、實驗用品材料蟾蜍器材光學(xué)顯微鏡載玻片剪子鑷子染色缸水浴箱解剖針解剖盤試劑四、步驟涂片固定染色鏡檢甲基綠派洛寧染色液三氯醋酸堿性固綠將蟾蜍用脊髓破壞法處死，打開胸腔，暴露心臟，取心臟血做血涂片，室溫晾干。將晾干的涂片浸入乙醇固定’，室溫晾干。在標(biāo)本上滴數(shù)滴甲基綠派洛寧，染色’，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去玻片上多余的水分(不要吸的太干)。內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示一、原理蛋白的基本組成單位是天然大多為α。由于α碳原子上側(cè)鏈基因的結(jié)構(gòu)和極性的不同，按它們在中性溶液中側(cè)鏈解離狀態(tài)，而分成中性、堿性、酸性顯電性，某些酸性較多的蛋白在中性溶液中必然是酸性基團解離多于堿性基團，其分子表面帶負(fù)電荷，可以分別用代表酸性蛋白，中性蛋白和堿性蛋白。據(jù)此，可將標(biāo)本用三氯醋酸處理將核酸抽提出來后，用不同值的固綠染液分別染色。固綠的特性是與不帶電荷的大綠可將酸性蛋白染色；同理，堿性固綠可將堿性蛋白染色。由于核酸為帶負(fù)電荷的大分子，可被酸性固綠染色，因此要用三氯醋酸抽提出核酸后再進行染色。二、存在部位酸性蛋白一般是與是指組蛋白，主要存在于三、步驟涂片伴生的蛋白，所以存在于質(zhì)中，核仁內(nèi)也存在；而堿性蛋白主要三氯醋酸處理將已固定的血涂片浸入預(yù)熱℃的三氯醋酸中、’后用蒸餾水反復(fù)沖洗，除去三氯醋酸殘液，用吸水紙吸干水分(染色成功的關(guān)鍵)染色將涂片分別放入酸性固綠()中染色’，在堿性固綠()中染’，晾干鏡檢。無機物：水、無機鹽Cell小分子：單糖、FA、AA有機物大分子：蛋白、核酸固定：生物組織在染色前必須固定，使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不至于以后的染色等處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。原理的制備與分析對于在了解基因表達在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)的一個典型的哺乳動物細(xì)胞約含，但其中大部分酸鏈。這個群體編碼廣泛存在，導(dǎo)致在制備過程中，制備的的純度和完整性對，至關(guān)重要的一環(huán)。因此，在制備過程中必須嚴(yán)格操作，防止析能順利進行。和各種低分子，只有為的3’末端都帶有一段較長的多腺苷易于被降解，操作難度較大，而且所在制備過程中，必須注意控制酶的活性，由于很容易被酶降解，加上酶穩(wěn)定而且廣泛存在，因此在提取過程中要嚴(yán)格防止酶的污染，并設(shè)法抑制其活性。外源性酶可以通過玻璃制品，塑料制品和電泳槽、手、污染的溶液污染制品。所有的玻璃器皿均應(yīng)于使用前℃干烤3或更長時間，塑料器皿可用浸泡或用氯仿洗滌。電泳槽用去污濟洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3溶液中，室溫下放置，然后用處理水徹底沖洗電泳槽。最好物品專用。全部實驗過程最好載一次性手套，按觸可能污染了酶的物品后，應(yīng)更換手套，配制的溶液應(yīng)盡可能用在3℃處理以上，然后高壓滅菌除去殘留的。不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)水配制處理過的無菌蒸餾配制。然后用濾膜過濾除菌。：焦碳酸二乙酯，一種強烈但不徹底的酶抑制劑，它通過和酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)從而抑制酶的活性。：酶的蛋白抑制劑從人的胎盤中分離出來可以和多種酶結(jié)合使其失活該制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應(yīng)棄之。在酚抽提的過程中應(yīng)不斷添加新鮮抑制劑。對酶有抑制作用。一、準(zhǔn)備棉；二支鑷子；一次性手套；架子(個)；(專用)二、用品處理瓶子刷干凈3配水，3，振蕩混勻，過夜()將槍頭，管子浸入水中，振蕩混勻，過夜()將水倒入其它瓶子遲量倒干凈，離壓水(第一次)，另裝水壓一次。(第一次)洗槍頭，之后倒出，離壓水(第二次)(第二次)洗槍頭，之后倒出，將水槍頭分別高壓(第三次)將高壓鍋中水倒掉，加入新重復(fù)放好，備配高壓一次。乙醇及實驗中洗槍頭的水放好，備配，制膠用槍頭，℃干烤，隔半小時振蕩一次，至干。蓋上一次性手套。三、步驟進入無菌室后空調(diào)設(shè)置℃，冷風(fēng)，持續(xù)。無菌臺打開殺菌燈分鐘，之后關(guān)閉不開排風(fēng)。所有用品須殺菌分鐘?！胬鋬鲭x心機預(yù)冷待用。冰盒待用。℃℃水浴鍋待用。裂解細(xì)胞，滋勻后室溫放置，用一次性注射器反復(fù)抽打直至沒有團(此時可懸浮離心后，每×個動、植物或酵母，×個細(xì)菌。對于富含、脂肪、多糖、細(xì)胞外物質(zhì)的(：脂肪組織)℃，離心分鐘，取上清至另一個新管子。每加氯仿，劇烈震蕩鈔后，室溫孵育分鐘，不用漩渦振蕩器，以免基℃離心分鐘。離心后分三層下層淡紅色為酚氯仿相中間層和無色的上層水相(含)吸上層水相至另一離心管中(約)的沉淀：每加異丙醇，室溫放置的洗滌(次)：每加乙醇。渦注漩震蕩混勻。用的水溶解，吹打幾次后，℃℃孵育分鐘，每組織加保存前置于冰上?！姹４?需要長期保存的，存于檢測過程泳儀、錐形瓶(上樣電泳紫外觀察檢樣水補至濃度檢測樣品→稀釋倍→至①水沖洗比色杯②加樣，測次③測后用水沖洗④用正常沖洗膠膠×→瓊脂糖上樣的提取消大紫外設(shè)置℃離心機無菌室收獲將各管離心℃每管加(組織或×細(xì)胞加等有影響的物質(zhì)深沉。，加氯仿，劇烈振蕩，，上清移入干凈管(不要貪多，否則會將中間吸出，寧可多扔一些)加異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)混勻，動作不要太劇烈)。不利于溶于加℃離心可見白色半透明深沉棄上清，乙醇(水配制)洗?！骐x心，可見白色半透明深沉，將上清盡量吸干凈，室溫干燥，不要太干，否則。提取全血，用甘素抗凝，管血倍體積()裂解液，全血吹吸混勻，移至氯仿，劇烈振蕩鈔。管中。棄上清。重復(fù)次，共洗次。。吸上清到新離心管，加℃，棄上清(可見，絮狀，半透明)棄上清，室溫晾干(不可太干)注：離心時注意管方向，整個過程要快。紅細(xì)胞裂解液調(diào)全血加洗次裂解液提取處理研缽、磨口瓶(水處理)準(zhǔn)備管子、槍頭、液氮酒精棉處理超凈臺、異丙醇、無水乙醇、氯仿、，加樣器、鑷子、試管架預(yù)熱離心機準(zhǔn)備冰盒，取研缽；液氮取組織，無菌取樣管子放入液氮。研磨組織(黃豆粒大小)在液氮中進行。邊研磨邊加液氮。將研磨好的組織，倒入準(zhǔn)備好的管子。用研磨棒蓋住管口，當(dāng)聽不到響聲后，放超凈臺的試管架。每管加(組織或×細(xì)胞加)用槍混勻，輕置上清移入干凈管(不要貪多，否則會將中間吸出，寧可多扔一些)加異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)混勻，動作不要太劇烈)?！骐x心，可見白色半透明深沉，棄上清，乙醇(水配制)洗?！骐x心，可見白色半透明深沉，將上清盡量吸干凈，室溫干燥，不要太干，否則不利于溶于。。收獲用于提取時或提取時，在無菌室消化，培養(yǎng)液中止消化，吹打，離心()用沖洗，轉(zhuǎn)移至管內(nèi)備用。細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，用培養(yǎng)液終止消化后，將吹打下的懸液離心后(以下，)再接種到培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞系提前處理提取細(xì)胞系可先在無菌室內(nèi)收獲細(xì)胞(不提膜蛋白，才用胰消化)細(xì)胞進入指數(shù)生長期，達時，棄培養(yǎng)基，沖洗，胰消化。棄上清，加，吹打，將懸液轉(zhuǎn)至管中，帶出無菌室。之后操作應(yīng)在冰上進行若提膜蛋白，則不用胰棄上清，加，開始提。消化，用細(xì)胞刮子收獲細(xì)胞。一、試劑的配制裂解緩沖液去氧膽酸鈉現(xiàn)配取＋調(diào)至，然后加入＋＋去氧膽酸鈉＋，最后定容至。注：溫度低，溶解度不好，液體表面形成一層膜，加熱后可消失，不宜配多，即可。裂解液的(抑蛋白酶肽)一次一個小包裝用溶解取加水，用調(diào)至，然后定容至。原液濃度配時，取溶液溶于②：取溶于水中，分裝管，℃保存。③疊氮鈉：取溶于，分裝管，℃保存。④(苯甲磺酰氯)：：取用異丙醇定容至，配成濃度為的儲存液，管，℃保存。：取儲存液稀釋倍，分裝管，℃保存。⑤(抑亮蛋白酶肽)：分裝管，只許凍融一次。⑥(二硫蘇糖醇)：加水定容至，分裝管，℃保存。裂解液＝裂解緩沖液＋①②③④⑤各＋⑥1×上樣緩沖液×甘油()溴酚蘭的配制：×甘氨酸電泳緩沖液(×＋容至。)甘氨酸加水定溶至應(yīng)用液為×：×甘氨酸加水定容至應(yīng)用液為×：丙烯酰胺丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺該轉(zhuǎn)移緩沖液該水℃定容至，℃避光保存于棕色瓶中。分離膠緩沖液調(diào)值積層膠緩沖液調(diào)值過硫酸銨過硫酸銨℃保存，只能連續(xù)使用一周。染膠時考馬斯亮蘭染液考馬斯亮蘭水無需此步封閉液二、測定方法裂解樣品更長時間取上清分裝②取℃保存的蛋白組織，加入裂解液，液氮研磨裂解，℃放置離心，取上清分裝管，℃保存，一周內(nèi)使用。樣品蛋白含量測定參見標(biāo)準(zhǔn)蛋白檢測說明書，用裂解液配制成同一濃度。樣品處理×上樣緩沖液＋樣品上清裂解液，混勻后沸水浴上煮沸保存1周。上樣量最大為一般為左右，蛋白含量在為宜，或離心或為灌分離膠聚丙烯酰胺的有效分離范圍線線性分離范圍~~~~丙烯酰胺濃度()加水封，去水封，加梳子，加入積層膠，將膠板放到電泳槽，內(nèi)加電泳緩沖液沒過低板后取梳子(兩邊液體不能接觸，內(nèi)液高于外液；單塊板時，另一面加上特制板，以免短路)電泳條件：恒壓，積層膠，分離膠至染料到膠底部。5轉(zhuǎn)膜先按膠大小取等大的纖維素膜塊和等大濾紙張(膜上膜下各張)，然后在一方盤中倒入×轉(zhuǎn)膜液，把轉(zhuǎn)膠的海綿放入浸濕，在海棉中間先放上張濾紙，然后放入膠，再放上膜，最后放上張濾紙，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中，膠負(fù)膜正，加上轉(zhuǎn)移液膜，最好低溫，電壓恒壓(膠無反正，膜無反正)。雜交反應(yīng)①調(diào)平搖器至℃②將膜用去離子水洗③封閉液℃平搖，蓋蓋，防止蒸發(fā)④加入一抗，溫育℃雜交箱平搖⑤用洗次，每次⑥加入二抗，溫育℃平搖一抗配方：稀釋度∶倍，用封閉液稀釋二抗配方：稀釋度∶倍，用封閉液稀釋⑦用洗次，每次⑧用洗次，每次顯色準(zhǔn)備工作壓水浸泡(多一些)、(玻璃蓋嵌縫)。槍頭小時。濾紙插入瓶口置于℃烤箱中(時時換方向傾去管內(nèi)的水)，烤干需天。研缽步驟一、提取先調(diào)離心機與待機狀態(tài)℃。入的量與組織大小有關(guān)，離，徹底勻漿至液態(tài)移入管中。箱℃、℃?zhèn)溆?。最后一個樣品處理完成后開始計時，室溫置。離心℃。取上清液，室溫置。加入三氯甲烷調(diào)上樣器，黃色置。置離心℃。仔細(xì)取上清液用槍頭分次仔細(xì)吸取，且留下一定空間以防抽取出下層蛋白部分)，然后加入的異丙醇，用手振蕩混勻，室溫置。離心℃。此步有時間準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄工作，取出逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的分裝于個棄液體，管倒置于濾紙上盡量吸干，以便乙醇清洗干凈，但也應(yīng)注意動作輕柔，以防深沉物落在濾紙上。加入乙醇(無水乙醇高壓后的水)清洗，旋渦振蕩使沉淀懸起。離心℃，棄上清。濾紙先反復(fù)吸干水滴，盡量控盡，然后倒置于濾紙上，室溫空氣干燥。加入水(‰高壓后的水也可)，用以溶解(未換槍頭，離心)。取少量檢測其濃度。調(diào)機：蒸餾水反復(fù)沖洗比色杯，以此標(biāo)準(zhǔn)調(diào)零。取加入至的去離子水中，全部抽取測定樣品濃度(加入至無需無菌處理的測得濃度六例：吸光度比值濃度加水量①②③④⑤⑥此次最小值，這是管中加水才能保證濃度一致。另總反應(yīng)體積是二、逆轉(zhuǎn)錄合成中需加的量，管中還剩，故需×向各，可以反應(yīng)的溶質(zhì)，故需加模板。在冰盒上操作取總置℃水浴，短暫離心，立即冰浴，加去酶水配成等量份樣品?！烈铩?樣本例數(shù))酶后加模板加水補足至所計算的補水量×，旋渦振蕩，短暫離心，模板冰浴。上述物質(zhì)分別加入個新的管中(每管含模板混合液共)，旋渦振蕩，短暫離心，其余樣品℃保存。混勻后置℃水浴分鐘。此步有時間配制擴增準(zhǔn)備℃水浴用以滅活酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)，并使，雜合分子變性解離。加入去酶水，振蕩混勻。冰浴取樣，取上下游引物各放入個管內(nèi)(所測指標(biāo)數(shù)一個內(nèi)參照)?！薄薄薄迸浞磻?yīng)液(冰盒上操作)引物×酶后加模板即上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，最后加水先加同一指標(biāo))，(同一指標(biāo))，(，，，各組)分別加入上述試劑量(冰浴)，(旋渦振蕩，短暫離心后抽取個加入其余各組管內(nèi)模板)。旋渦振蕩，短暫離心，在適當(dāng)溫度參數(shù)下擴增℃?zhèn)€循環(huán)，未次循環(huán)后延伸分鐘?！妗妗妗妗獋€循環(huán)四、結(jié)果檢測瓊脂糖凝膠的配制()在乙加有×電泳緩沖液(×堿硼酸乙二按四乙酸，用調(diào)至加水至升)的三角錐形瓶或瓶蓋未擰緊的玻璃瓶中加入準(zhǔn)確稱量的()瓊脂糖粉(緩沖液不宜超過瓶的容量，電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液)。在錐瓶的瓶頸上松松的蓋上紙，在沸水浴或微波爐中(中火)將懸浮液加熱至瓊脂糖溶解(應(yīng)在最短時間里加熱時瓊脂糖顆粒全部融化，不時小心翼翼的搖動瓶使粘附在瓶壁上的顆粒均進入溶液，對于溶液的體積在煮沸時是否由于蒸發(fā)而尖少必要時用水補充)。使溶液冷卻至℃溶液冷卻至℃時加入溴化乙錠()，充分混勻。將膠模放在工作臺的水平位置上(用水平儀校正)，在距離底板的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可形成完好的加樣孔。將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中，凝膠的厚度在之間，檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。在凝膠完全凝固后(于室溫放置)，小心移去梳子，將凝膠放入電泳槽中。加入恰好沒過膠面約深的足量電泳緩沖液。加樣：每孔(藍樣)；(藍水)蓋上電泳槽并通電，使向陽極(紅色)移動，電壓為伏(兩極間距離)，至全部跑開。照相，分析。(酶聯(lián)儀測定琥珀酸脫氫酶活性)一、原理琥珀酸脫氫酶()是三羧酸循環(huán)中的重要酶，存在于線粒體內(nèi)膜上，是反應(yīng)線粒體功能的敏感標(biāo)志。線粒體是細(xì)胞功能的場所，其功能喪失意味著細(xì)胞生命的結(jié)束，因此可以根據(jù)的活性推知細(xì)胞活性。法即利用(噻唑蘭染料，四甲基偶氮唑鹽)來顯示細(xì)胞線粒體內(nèi)的活性，在有存在的部位，作用于底物()進行脫氧，脫下的氫與作用，氧化型的四唑鹽’(，的甲瓚(紫藍色))可以將甲瓚溶解，酶聯(lián)儀或還原成有色測其光密度得到值通過值可以計算不同條件下細(xì)胞的存活率。二、試劑三、步驟將貼壁生長的癌細(xì)胞，用胰酶消化、終止后，調(diào)整細(xì)胞密度為×每孔傳于孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期時加藥(約)。加藥培養(yǎng)后，在藥物終止前于各孔加入或者，將培養(yǎng)板放回℃孵箱，繼續(xù)培養(yǎng)(黃色→紫蘭色結(jié)晶)。吸棄培養(yǎng)液，各孔加入，將培養(yǎng)板振蕩。用酶聯(lián)儀測定光密度，通過與對照組值的比較得到實驗組的存活率。結(jié)果組各值取均值后，以下式計算存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。存活細(xì)胞％＝(實驗／對照)×注：空白組除不加細(xì)胞外正常組除不加藥物外其余均與加藥實驗組同樣處理。凝膠阻滯體系××體系××℃℃℃