生物化學(xué)檢驗(yàn)

永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院歐陵斌酶活性的測定方法及影響因素第二節(jié)酶活性測定方法及酶學(xué)分析類型Companyname

酶學(xué)分析是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一類檢測技術(shù)，包括酶活性測定和底物濃度測定兩大類型。酶活性的測定方法包括終點(diǎn)法和連續(xù)監(jiān)測法。Companyname一、酶活性的測定方法按照對酶促反應(yīng)時間的選擇不同連續(xù)監(jiān)測法固定時間法Companyname（一）固定時間法分類：

終點(diǎn)法：在反應(yīng)進(jìn)行到預(yù)定時間后要終止反應(yīng)。

兩點(diǎn)法：該方法反應(yīng)時間的預(yù)定是從t1～t2

。定義：測定酶促反應(yīng)開始后一段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。

Companyname特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)是簡單。

缺點(diǎn)是難以確定反應(yīng)時間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。

注意：固定時間法時間段的預(yù)定不宜太長，一般以30～60分鐘為宜。Companyname（二）連續(xù)監(jiān)測法2、原理：1、定義：測定底物或產(chǎn)物隨時間的變化量，又稱為速率法。

該方法每隔一定時間（10s～60s）測定一次底物或產(chǎn)物的變化量，連續(xù)測定多點(diǎn)，然后將測定結(jié)果對時間作圖，繪制反應(yīng)速度曲線。Companyname3、特點(diǎn)：在方法設(shè)計上，選擇紫外吸收法或色原顯色法

缺點(diǎn)：

要求高，要求能夠精確地控制溫度、pH值和底物濃度等反應(yīng)條件，要求儀器具有恒溫裝置及自動監(jiān)測功能，半自動及自動生化分析儀都能達(dá)到這些要求。優(yōu)點(diǎn):

能動態(tài)觀測酶促反應(yīng)進(jìn)程，可以明顯地找到反應(yīng)的線性期，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在較短時間內(nèi)完成測定。

4、連續(xù)監(jiān)測法的種類1.直接連續(xù)監(jiān)測法要求底物或產(chǎn)物能夠直接測定2.間接連續(xù)監(jiān)測法間接法又分為一步間接法和酶偶聯(lián)法。酶偶聯(lián)法指在原來的反應(yīng)體系中再加入一些酶試劑，使加入的酶促反應(yīng)和被測酶的酶促反應(yīng)偶聯(lián)起來。最后的反應(yīng)產(chǎn)物可直接監(jiān)測，進(jìn)而推測出第一個酶的活性濃度。Companyname5、酶活性濃度的計算摩爾消光系數(shù)()的定義為在特定條件下，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時的吸光度。如用連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化(△A/min)，以U/L表示酶活性濃度時，則按下式進(jìn)行計算：Companyname式中：V—反應(yīng)體系體積(ml)--摩爾消光系數(shù)(cm2·mol-1)v—樣本量(ml)L—比色杯光徑(cm)△A—吸光度變化106為換算系數(shù)，將mol換算成molCompanyname一、工具酶定義：偶聯(lián)：工具酶與待測酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。工具酶：將作為試劑用于測定待測酶活性或底物濃度的酶。工具酶有氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類分類：第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)Companyname表7-2常用工具酶的名稱及其縮寫符號

名稱縮寫符號名稱縮寫符號乳酸脫氫酶LDH蘋果酸脫氫酶MDH6-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PD谷氨酸脫氫酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD膽固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO過氧化物酶POD己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL膽固醇酯酶CE脲酶肌酐酶Companyname二、工具酶用于偶聯(lián)測定應(yīng)用：對于底物或產(chǎn)物不能直接測定或難于準(zhǔn)確測定的酶促反應(yīng)。ExEaEiABCP

式中A為底物，B、C為中間產(chǎn)物，P為產(chǎn)物（必須能夠直接測定），Ex為待測酶，Ea、Ei都為工具酶。按照工具酶作用的不同，Ea又稱為輔助酶，Ei又稱為指示酶，CP稱為指示反應(yīng)。Companyname（一）酶偶聯(lián)反應(yīng)的原理

在應(yīng)用酶偶聯(lián)法測定時，關(guān)鍵在于確定恒態(tài)期，因?yàn)橹挥泻銘B(tài)期才能代表酶活性。如酶促反應(yīng)底物動力學(xué)所述，恒態(tài)期可以通過測定指示酶的Km和Vmax等動力學(xué)因數(shù)加以計算確定。Companyname（二）常用指示酶及其指示反應(yīng)1．脫氫酶

用作工具酶的脫氫酶都是以NAD(P)H為輔酶的脫氫酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它們催化下列反應(yīng)：P+NAD(P)H+H+

PH2+NAD(P)+可對NAD(P)H在紫外吸收或紫外激發(fā)熒光進(jìn)行測定應(yīng)用：ALT、AST、CK等酶活性測定。Companyname2．過氧化物酶POD可催化過氧化氫與某些色原反應(yīng)，例如與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，將其氧化為有色物質(zhì)，反應(yīng)如下：POD2H2O2+4-AAP+酚