滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校王鳳玲滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校王翠翠檢驗(yàn)儀器分析技術(shù)教學(xué)要求掌握：流式細(xì)胞儀的工作原理、分類與基本結(jié)構(gòu)。熟悉：流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)、操作與日常維護(hù)。了解：血細(xì)胞分析儀的主要應(yīng)用。流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀流式細(xì)胞儀的工作原理一、分析型流式細(xì)胞儀的工作原理經(jīng)過(guò)特異熒光素染色的單細(xì)胞懸液樣品，在氣體壓力的作用下進(jìn)入FCM的流動(dòng)室；與鞘流液在流動(dòng)室混合形成層流，自噴嘴口逐一連續(xù)射出；單個(gè)排列的細(xì)胞表面的熒光素被與其垂直的特定波長(zhǎng)的激光束照射，產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射；光信號(hào)經(jīng)光電倍增管和光電二極管轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)，并經(jīng)過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器以電子脈沖的形式被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)接收；計(jì)算機(jī)通過(guò)相應(yīng)的軟件分析得出細(xì)胞的生物學(xué)特征。一、分析型流式細(xì)胞儀的工作原理FluorescenceFALSSensor二、分選型流式細(xì)胞儀的工作原理分選型FCM是在分析型FCM的基礎(chǔ)上增加了分選系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光路系統(tǒng)信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析與顯示系統(tǒng)分選系統(tǒng)分析型FCM分選型FCM一、液流系統(tǒng)

流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開(kāi)一個(gè)孔，供細(xì)胞單個(gè)流過(guò)，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)抱。樣品流在鞘流的環(huán)抱下形成聚焦，保證每個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。

流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀

由于激光焦點(diǎn)處的能量分布為正態(tài)分布，中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時(shí)，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同。所以，要根據(jù)檢測(cè)的要求調(diào)整流速流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀前向角散射光（FSC）FSC與細(xì)胞的大小有關(guān)二、光路系統(tǒng)二、光路系統(tǒng)側(cè)向角散射光(SSC)SSC與細(xì)胞的顆粒性及其內(nèi)部復(fù)雜程度有關(guān)，反映細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)等信息。利用FS與SS信號(hào)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞二、光路系統(tǒng)當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。三、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)四、數(shù)據(jù)分析及顯示系統(tǒng)

設(shè)門技術(shù)單參數(shù)分析、雙參數(shù)分析和多參數(shù)分析

1.散射光信號(hào)散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀2.熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過(guò)特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀19直方圖分析流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀20散點(diǎn)圖分析流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀21等高圖和密度圖分析流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀五、分選系統(tǒng)純化模式富集模式單細(xì)胞模式1．水滴的形成2．水滴的充電

3．水滴的偏轉(zhuǎn)

流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)儀流式細(xì)胞儀的的主要性能指標(biāo)主要性能指標(biāo)靈敏度熒光靈敏度：≤200MESF(FITC)≤100MESF(PE)FSC檢測(cè)靈敏度：≤1μm分辨率：CV≤2%表面標(biāo)志物檢測(cè)準(zhǔn)確性和重復(fù)性：測(cè)定值在給定范圍內(nèi)和CV≤10%。分析速度：一般為3000～6000個(gè)細(xì)胞/秒。分選指標(biāo)分選速度：一般為1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/秒左右分選純度：一般可以達(dá)到98%以上分選收獲率：一般可達(dá)95%以上其它指標(biāo)：在熒光線性方面，F(xiàn)CM熒光強(qiáng)度的線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.98；在儀器穩(wěn)定性方面，在環(huán)境溫度變化不超過(guò)設(shè)定溫度的5%時(shí)，8小時(shí)內(nèi)檢測(cè)FSC及所有熒光通道峰值的波動(dòng)范圍應(yīng)不超過(guò)10%；儀器的攜帶污染率應(yīng)不大于1%。

主要性能指標(biāo)第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要點(diǎn)

一、樣品制備關(guān)鍵點(diǎn)：制備單細(xì)胞懸液常見(jiàn)細(xì)胞類型外周血中的單個(gè)核細(xì)胞懸浮細(xì)胞貼壁細(xì)胞實(shí)體臟器標(biāo)本二、熒光素標(biāo)記分類抗原分子檢測(cè)：FITC、PE、花青素5和7、多甲藻葉綠素蛋白和別藻青蛋白等。示蹤：綠色熒光蛋白等。DNA分析：煙酸己可堿33342和碘化丙啶等。離子測(cè)定：Fluo4等。封閉：避免了Fc受體的干擾。標(biāo)記方法：直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。三、對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照設(shè)置：主要為同型對(duì)照，目的是消除熒光素的影響。陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置：作用是在使用某種熒光素偶聯(lián)抗體之前先檢測(cè)該熒光素偶聯(lián)抗體是否有效。四、儀器操作流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用一、生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用細(xì)胞群比例測(cè)定是FCM最基本的功能，淋巴細(xì)胞亞型測(cè)定是最典型的例子。一、生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)的有序的死亡，是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，已知與個(gè)體發(fā)育、衰老、腫瘤發(fā)生和自身免疫病等有關(guān)?；罴?xì)胞為

AnnexinV-/PI-壞死細(xì)胞為

AnnexinV+/PI+凋亡細(xì)胞

AnnexinV+/PI-自身免疫性疾病-HLA-B27檢測(cè)強(qiáng)直性脊椎炎，HLA-B27陽(yáng)性率為90%，其表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度相關(guān)性。陽(yáng)性標(biāo)本陰性標(biāo)本二、臨床診斷中的應(yīng)用本章小結(jié)FCM的主要性能指標(biāo)包括靈敏度、分辨率、表面標(biāo)志物檢測(cè)準(zhǔn)確性和重復(fù)性、分析速度、分選相關(guān)指標(biāo)（分選速度、分選純度和分選收獲率等）、熒光線性和儀器穩(wěn)定性等。FCM的技術(shù)要點(diǎn)主要體現(xiàn)在樣品制備、熒光素標(biāo)記、對(duì)照設(shè)置和儀器操作等方面。課堂練習(xí)1.流式細(xì)胞術(shù)是利用多技術(shù)方法對(duì)處于快速流動(dòng)的____或____進(jìn)行自動(dòng)化多參數(shù)____或____的技術(shù)。

2.激光是