小鼠脾臟細(xì)胞原代培養(yǎng)及觀察計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)背景：一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素2?細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，C02培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件：液氮罐二、凈化工作室：------我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)——潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)±0.5um±5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,000乙0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。Zeiss濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。

II1(2000ltlC02培養(yǎng)箱：II1(2000ltlC02培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37°C,5%CO2。使用C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90C，14h）。il箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。il三、細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制：1.水：新鮮配置的三蒸水或去離子水2.平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HP04.H201.56gKH2P040.20加水至1000ml消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限，成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：A多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；B多種金屬離子；C激素；D促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；E各種生長因子；F轉(zhuǎn)移蛋白；G不明成分。一般說來，含5%小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清．對(duì)于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞．無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。向無清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56°C，30分鐘血清的消毒：過濾除菌抗菌素的使用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定。完全培養(yǎng)基的組成：

血清碳酸氫鈉青、鏈霉素培養(yǎng)基的配制：RPMI-1640培養(yǎng)粉碳酸氫鈉青、鏈霉素80％一血清碳酸氫鈉青、鏈霉素培養(yǎng)基的配制：RPMI-1640培養(yǎng)粉碳酸氫鈉青、鏈霉素5％一20％2.0g/L各100單位／毫升1袋2.0g各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過濾除菌；調(diào)節(jié)pH值至7.2；加血清（終濃度10％）。主要培養(yǎng)基:MEM：低限量Eagle培養(yǎng)基DMEM：Dulbecco'sModifiedEagleMedium，貼壁細(xì)胞IMDM：Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium，密度低、生長困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞RPMI1640：Moor等研制成功，懸浮、腫瘤、原代、傳代等細(xì)胞199、109培養(yǎng)基：Morgan研制成功Mccoy's5A：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞四、培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌：1.清洗:玻璃器皿：一般用毛刷和洗滌劑進(jìn)行清洗，以去除器皿的雜質(zhì)。要注意兩點(diǎn)：一是洗刷時(shí)不宜用力過猛，二是不能留有死角，特別要注意瓶角度等部位的洗滌。洗刷后用蒸餾水沖洗三次，去離子水沖洗一次。晾干膠塞蓋子等雜物:細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。塑料制品的清洗:塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。泡酸 泡堿玻璃器皿:玻璃器皿一般用由濃硫酸，重鉻酸鉀及蒸餾水配制而成的清潔液浸泡。清潔液配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。泡酸時(shí)應(yīng)將器皿輕輕放入，避免灼傷；還應(yīng)是器皿內(nèi)全部充滿清潔液不留氣泡；一般浸泡過夜。膠塞蓋子等:清洗后將用品放入1mo/LNaOH中浸泡6-7h。物理消毒滅菌法：熱力消毒滅菌法：利用熱力作用破壞微生物的蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，導(dǎo)致其死亡，可分為干熱法和濕熱法。A燃燒法：屬于干熱法，是一種簡(jiǎn)單、迅速、徹底的滅菌方法。用途：a無保留價(jià)值的污染物品。b金屬器械及搪瓷類物品急用，或無條件消毒時(shí)，銳利刀剪除外，以免鋒刃變鈍。方法：a金屬器械可在火焰上燒20秒。b搪瓷類容器可倒入少量95%乙醇。B干烤法：利用特制的烤箱，熱力通過空氣對(duì)流和介質(zhì)傳導(dǎo)進(jìn)行滅菌，效果可靠。C煮沸消毒法：屬于濕熱法，用于耐濕、耐高溫的搪瓷、金屬、玻璃，橡膠類物品，不能用于外科手術(shù)器械的滅菌。從水煮開始計(jì)時(shí)，5-10分鐘可殺滅繁殖體，15分鐘可將多數(shù)細(xì)菌芽胞殺滅，如破傷風(fēng)桿菌芽胞需煮60分鐘才可殺滅，在水中加入碳酸氫鈉，配成濃度為1%-2%的溶液時(shí)，沸點(diǎn)可達(dá)105度，即可增強(qiáng)殺菌作用，又可去除防銹。注意：a物品需全部侵入在水中，物品蓋子打開，軸節(jié)打開，空腔導(dǎo)管預(yù)先灌水，各種大小及形狀相同的容器不能重疊。b玻璃類物品需用紗布包裹，并在冷水或溫水中放入。c橡膠類物品需用紗布包好，水沸后放入。d如中途加入其它物品，需等再次水沸后開始計(jì)時(shí)。e高原地區(qū)氣壓低，沸點(diǎn)低，需適當(dāng)延長煮沸時(shí)間，一般海拔每增高300m，煮沸時(shí)間延長2分鐘。D壓力蒸汽滅菌法：屬于濕熱法，是一種臨床上應(yīng)用最廣泛，效果最為可靠的首選滅菌方法光照消毒法（又稱輻射消毒）主要是通過紫外線的殺菌作用，使菌體蛋白發(fā)生光解、變性,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。A日光暴曬法：利用日光的熱、干燥、紫外線的作用來殺菌，將床墊、毛毯、書籍、衣服等放在陽光下直射，暴曬6小時(shí)可達(dá)到消毒效果，中間要定時(shí)翻動(dòng)。B紫外線燈管消毒法：紫外線屬于電磁波輻射，常用于空氣、物品表面的消毒，殺菌最強(qiáng)的波長范圍250-270nm從燈亮5-7分鐘開始計(jì)時(shí)。注意：a空氣消毒：有效距離不超過2m,照射時(shí)間20-30分鐘。b物品消毒：有效距離不超過25-60cm，照射時(shí)間20-30分鐘。注意事項(xiàng)：A保持室內(nèi)清潔、干燥，室內(nèi)溫度20-40度，相對(duì)濕度40%-60%時(shí)，紫外線消毒最為宜。B保持紫外線燈管清潔，一般每2周用無水乙醇擦拭1次，發(fā)現(xiàn)有污洉應(yīng)隨時(shí)擦拭。C保護(hù)眼睛和皮膚：紫外線對(duì)眼睛和皮膚有刺激作用，易引起眼炎、皮炎且臭氧對(duì)人體不利，因此一般不在有人的環(huán)境中使用，必須使用時(shí)應(yīng)帶防護(hù)鏡，穿防護(hù)衣，或用被單遮蓋肢體。D紫外線穿透力較差，消毒時(shí)物品應(yīng)攤開或掛起，且定時(shí)翻動(dòng)及保證各表面均受到直接照射，如需再次開啟，應(yīng)間隔3-4分鐘。E定期檢測(cè)紫外線燈管照射強(qiáng)度，一般每隔3-6個(gè)月1次，或建立登記卡，使用時(shí)間超過1000小時(shí)應(yīng)予以更換。F定期做空氣培養(yǎng)檢測(cè)消毒效果。臭氧滅菌消毒法：利用臭氧強(qiáng)大的氧化作用進(jìn)行殺菌。A用途：主要用于空氣、醫(yī)院污水、診療用水、物品表面的消毒。B方法:使用時(shí)應(yīng)關(guān)閉門窗，人員離開房間，消毒結(jié)束后30分鐘方可進(jìn)入。電離輻射滅菌法（又稱冷滅菌）適用于不耐熱的物品消毒，如橡膠、塑料、高分子聚合物（一次性注射器、輸液輸血器等）、緊密醫(yī)療儀器、生物醫(yī)學(xué)制品、節(jié)育用具及金屬等。微波消毒滅菌法微波可殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌、病毒、細(xì)菌芽胞、真菌孢子等各種微生物。常用于食品、餐具的處理，化驗(yàn)單據(jù)、票證的消毒，醫(yī)療藥品、耐熱非金屬材料及器械的消毒滅菌。不能用于金屬物品的消毒?；瘜W(xué)消毒滅菌法：化學(xué)消毒滅菌法是利用液體或氣體的化學(xué)藥物滲透到菌體內(nèi)，使菌體蛋白凝固變性，細(xì)菌酶失去活性，導(dǎo)致微生物代謝障礙而死亡，或破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變其通透性，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、溶解，以達(dá)到消毒滅菌的目的?；瘜W(xué)消毒劑的使用原則A待消毒的物品的物品須先洗凈、擦干B根據(jù)不同物品的性能及各種微生物的特性，選擇恰當(dāng)?shù)南緞?。C嚴(yán)格掌握消毒劑的有效濃度、使用方法及消毒時(shí)間D消毒液中一般不放置紗布、棉花等物，以免因吸附消毒劑而降低消毒效力。E消毒物品應(yīng)全部侵沒在消毒液內(nèi)，器械的軸節(jié)應(yīng)打開，套蓋應(yīng)掀開，管腔掛滿消毒液。F浸泡消毒后的物品使用前應(yīng)先用無菌生理鹽水沖洗，氣體消毒后的物品使用前應(yīng)待氣體散發(fā)后，以免殘留消毒劑刺激組織。G消毒劑應(yīng)定期檢測(cè)，調(diào)整濃度，進(jìn)行更換，易揮發(fā)的要加蓋。②化學(xué)消毒劑的使用方法A浸泡法：常用于耐濕、不耐熱的物品，如銳利器械、精密器材等的消毒B擦拭法：常用于桌椅、墻壁、地面等的消毒。C噴霧法：常用于桌椅、墻壁、地面等物品表面的消毒。D熏蒸法：常用于空氣和不耐濕、不耐高溫物品的消毒?？諝庀荆撼Ｓ玫南緞┯?%過氧乙酸、純?nèi)樗?、食醋物品消毒：常用于甲醛消毒箱進(jìn)行。環(huán)氧乙烷氣體密閉消毒滅菌法：穿透力強(qiáng)，是高效廣譜殺菌作用，為滅菌劑常用的化學(xué)消毒劑A高效類消毒劑能殺滅芽胞a碘酊：2%碘酊，不能用于粘膜的消毒b過氧乙酸：使用方法有浸泡法、噴霧法、熏蒸法。0.2%溶液用于手的消毒，浸泡2分鐘，5%溶液用于餐具消毒，浸泡30-60分鐘；1%-2%溶液用于室內(nèi)空氣消毒；1%溶液由于體表消毒，浸泡30分鐘。使用中須注意：現(xiàn)用現(xiàn)配；高濃度有腐蝕性、刺激性；放陰涼處，以免爆炸。c2%戊二醛：用于浸泡器械及內(nèi)鏡等，消毒30-60分鐘，滅菌要10h。d含氯消毒劑有漂白粉。B中效類消毒劑殺滅殺菌繁殖體、病毒，不能殺滅芽胞a乙醇：70%乙醇用于皮膚消毒、浸泡器械。不能用于粘膜及創(chuàng)面消毒。b碘伏：5%碘伏用于皮膚粘膜消毒。C低效消毒劑不能殺滅芽胞和部分細(xì)菌、病毒（如苯扎溴銨）五、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：1.復(fù)蘇：把凍存管從液氮中取出來，立即投入42°C水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后（大概1-2分鐘）。把上述細(xì)胞懸液吸到惡評(píng)EP管或離心管中，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘。把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞完全懸浮。吸到裝有培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中前后左右輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞均勻分布。標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。2或3天換一次培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代。把原來的培養(yǎng)基吸掉，加PBS沖洗1到2次，棄掉PBS。加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-3分鐘。待細(xì)胞都變圓后加如入含血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞完全都懸浮起來。把細(xì)胞吸到EP管或離心管中，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘。倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞完全都吹起來。根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。凍存細(xì)胞處理同二步驟中的前6步。第七步用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來，分裝到凍存管中，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。4°Cl0min，-20°C30min，-80°C過夜，然后放到液氮灌中保存?；蛑苯臃艃龃婧兄校俜诺?80冰箱。凍存液的配制：FBS：完全培養(yǎng)基：DMS0=5：4：1六、補(bǔ)充：原代細(xì)胞的培養(yǎng)法：組織培養(yǎng)法：組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長，方法簡(jiǎn)便，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長成肉眼可以觀察到的生長暈，5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)方法如下：A按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤。B將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2cm~0.5cm,—般在25mL培養(yǎng)瓶（底面積為17.5cm2）可接種20~30小塊為宜，小塊放置后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶?jī)A斜放置在37C溫箱內(nèi)。培養(yǎng)2~4小時(shí)，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動(dòng)作要輕，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。消化培養(yǎng)法：該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液，然后分瓶培養(yǎng)。某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法：對(duì)于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。器官培養(yǎng)：器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。A器官培養(yǎng)的特殊的要求需要特殊的培養(yǎng)條件因器官離體培養(yǎng)，其營養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來供給，因此，培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營養(yǎng)而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過1mm.器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入常采用以下兩種方法：a將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。b提高培養(yǎng)基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5%C02，以維持pH.器官培養(yǎng)的方法a將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。b將培養(yǎng)基加入平皿中，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。c將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過200口m,水平面積不超過10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2.d將培養(yǎng)物置于C02培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓達(dá)90%,培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。e上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。七、國內(nèi)外細(xì)胞庫：國內(nèi)細(xì)胞庫；1_武漢細(xì)胞陣lit-tp:///fzlbc/cell,doc2-昆明細(xì)胞庫/CELL.HTM .王上海細(xì)胞斥 日u.ctiiZKikigao'ciatalogiiE.html4-協(xié)和醫(yī)科人學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心 —ht~tp:.-[?WWW,ccuns.占c-cn/pninc/jiaoHii亡_hj/EhcarLgdi;in_占”占-htni5?成都基因治療腫瘤藥物工程技術(shù)研究中心細(xì)胞及投體服務(wù)hVtp;「f 呂亡iluid世日ic uoiii?cnjeu].1_ca/t■遼].口昌?as■口中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫http:■'jtww.cellbank.-org.on/美國和歐洲細(xì)胞庫ATCC〔細(xì)胞株換胚胎干細(xì)胞庫〕亠載細(xì)胞庫目錄:littp:FFwww?atcc.arg/pdf/tel,pdf查詢細(xì)胞株littp:../SearchCat■過logs/CellBicilogiy.cfm2)胚胎丁細(xì).胞庫thttp:/'/stemoe11s.atc：c：.org/produets/ce11s.cfmCAEKIECilCC.DSJ1Z)http'、打蟲呻?匚曰b=i?due/Hvp亡匚Cnt/匚亡］1,htniCAMBE?EXh~t;F./可叼科?匚日mb匸亡瓦，coin/Coiit亡nt/Gmur耳1，'Cat■亂lcig'kip?a^p意大利I.A.Z.littp &己/113111>1:_亡11/匸亡1］..html弓?歐洲細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室列表〔大全〕lrttp: biotech,igt.uni^g.it/cldb』lsbz.ht>l意大利IZSLER細(xì)胞庫httl):fVww.bs. ituat■呂］■Oghifc巳llule/ABi病毒1代±p:..Pe笊.abion1.inE.uoin/pr■白duet盂/vieum已對(duì)tlmfaiilt.htm八、小鼠解剖圖：具體實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庠囵B(yǎng)的基本方法及操作過程。學(xué)習(xí)細(xì)胞消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)、營養(yǎng)液的配制及酸堿度的調(diào)節(jié)。初步掌握無菌操作方法。學(xué)會(huì)分辨死活細(xì)胞，掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織（或器官）取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，使其不斷生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)：便于研究各種理化因素對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響。細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞骨架等）、細(xì)胞生長及發(fā)育過程的觀察。因而是探索和顯示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的一種簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但是不可忽略它脫離了生物機(jī)體的一些變化。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)是指直接從動(dòng)物體內(nèi)獲得的細(xì)胞組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動(dòng)物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分散成單個(gè)游離的細(xì)胞，在人工培養(yǎng)的條件下，使其不斷地生長及繁殖。要細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。臺(tái)盤藍(lán)氧化與還原型顏色不同，活細(xì)胞由于新陳代謝產(chǎn)生較強(qiáng)還原力，染色后呈無色，死細(xì)胞染色后呈藍(lán)色。細(xì)胞計(jì)數(shù)以顯微鏡計(jì)數(shù)法進(jìn)行，即將少量待測(cè)樣品懸濁液置于特定的具有確定容積的載玻片上（計(jì)菌器），于顯微鏡下直接觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度（個(gè)/ml）=4個(gè)中等方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)-F4X10000X稀釋倍數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)用品：1.器材：徹底清洗、消毒、烤干、包裝好的：（解剖剪、解剖鑷、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、紗布?jí)K、吸管、橡皮頭、燒杯、移液槍、注射器、針頭、Eppendorf管）倒置相差顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、解剖板2.試劑：PBS緩沖溶液、培養(yǎng)液、臺(tái)盤藍(lán)3.用品：小白鼠四、實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞的原代培養(yǎng)斷頭法處死小鼠，將血放掉洗凈，在酒精中浸泡3min消毒。在超凈工作臺(tái)無菌操作，將小鼠背朝下放在解剖板上，用鑷子提起腹部皮膚，剪開。沿開口向兩側(cè)斜著剪開，翻起皮膚露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面條狀的脾，用彎頭鑷子取出脾，將周圍的脂肪組織去除。PBS緩沖液清洗1-2次待用。在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)加入PBS緩沖液30滴，用L型針頭吸取PBS0.2mL注入小鼠脾臟，用針頭在脾臟上戳幾個(gè)小孔，順脾臟輕輕刮，從小孔擠出分散的細(xì)胞。將培養(yǎng)皿傾斜，使大塊組織充分沉淀，吸取分散的細(xì)胞懸液2mL，1000r/min離心5min。取塑料培養(yǎng)皿一個(gè)，用“槍（ImL）”加入細(xì)胞培養(yǎng)液2mL，在蓋上加標(biāo)記后待用。用“槍（200口L）”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400口L，加入離心后并棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹散并混勻細(xì)胞，然后吸取200UL接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，放入37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞觀察、死活鑒定及計(jì)數(shù)取出培養(yǎng)物，觀察培養(yǎng)液的顏色。然后將培養(yǎng)皿置于倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況。取0.5mL細(xì)胞懸濁液于試管中，加1-2滴臺(tái)盤藍(lán)染液混合均勻，染色2min。將細(xì)胞懸液滴在計(jì)數(shù)器兩邊V字形槽內(nèi)。細(xì)胞懸液依毛細(xì)作用擴(kuò)散到計(jì)數(shù)區(qū)。在鏡下計(jì)數(shù)。取中間和四個(gè)角上的中等方格，計(jì)數(shù)每個(gè)方格內(nèi)死活細(xì)胞的數(shù)量。（注意：當(dāng)遇到位于大格線上的細(xì)胞，一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和右方線上的細(xì)胞。）先計(jì)數(shù)總細(xì)胞，再計(jì)數(shù)死細(xì)胞（藍(lán)色）。計(jì)算細(xì)胞死亡率。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察原代培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿呈粉紅色，未出現(xiàn)異味，未被污染。在倒置相差顯微鏡下觀察可看到聚集生長的細(xì)胞，形態(tài)不明顯。計(jì)數(shù)時(shí)觀察到游離的活細(xì)胞膜完整，形態(tài)多為近圓形，細(xì)胞質(zhì)均勻。細(xì)胞計(jì)數(shù)編號(hào)1234總數(shù)/個(gè)827685107死細(xì)胞數(shù)/個(gè)45424761活細(xì)胞數(shù)/個(gè)37363846細(xì)胞濃度（個(gè)/ml）=4個(gè)中等方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)-F4X10000X稀釋倍數(shù)活細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）=（37+36+38+46）/4*10000*5=1.9625*106活細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）=（45+42+47+61）/4*10000*5=2.4375*106活細(xì)胞率=活細(xì)胞濃度/活細(xì)胞濃度*100%=80.5128%六、分析與總結(jié)：取小鼠脾時(shí)注意保持其完整，注入緩沖液要慢而準(zhǔn)且適量，不要撐破脾臟，保證細(xì)胞分散游離出來。培養(yǎng)液PH為7.0~7.4，其中加有酚酞，正常狀況細(xì)胞生長過程代謝物使PH下降，培養(yǎng)液的顏色改變呈黃色，因此可通過培養(yǎng)液顏色變化初步判斷細(xì)胞生長狀況。生長狀況良好的細(xì)胞膜和核完整，細(xì)胞質(zhì)透明，而細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)較多顆粒狀或空泡證明細(xì)胞衰老。除游離期和衰退期外細(xì)胞一般貼壁生長。游離期細(xì)胞一般圓形，折光率高，而衰退期細(xì)胞皺縮，透明度下降，立體感很差，較易區(qū)分。倒置顯微鏡將物鏡與載物臺(tái)間的空間解放，可以允許連同培養(yǎng)皿一同觀察。七、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物篩選方法：①以端粒酶活性為作用靶點(diǎn)篩選抗腫瘤藥物端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu)，起著保護(hù)染色體的完整和穩(wěn)定性的作用，端粒酶是一種核糖核蛋白返轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，可以以自身的RNA為模板合成端粒末端。已發(fā)現(xiàn)在正常的體細(xì)胞和良性腫瘤組織中端粒酶活性是陰性，而在人體惡性腫瘤組織和人的腫瘤細(xì)胞株中都表達(dá)了很高的活性。因此，認(rèn)為端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展