反相高效液相色譜法測定溪黃草中二萜類成分的含量【摘要】目的通過溪黃草中二萜成分含量測定方法的建立及商品藥材質(zhì)量分析，為溪黃草質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。方法采用RPHPLC法測定6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的含量；流動相：%三氟乙酸乙腈，檢測波長：210nm；理論塔板數(shù)按6,7去氫羅伊林酮計算應不低于6000，按(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮計算應不低于5000。結(jié)果11批次的測試樣品中6,7去氫羅伊林酮的含量范圍在～μg·g-1，(15S)-12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的含量范圍在～μg·g-1，建議藥材中6,7-去氫羅伊林酮和(15S)-12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的含量限度分別不得低于μg·g-1和μg·g-1。結(jié)論經(jīng)過系統(tǒng)的方法學考察，所建立的測定方法具有操作簡便、穩(wěn)定、專屬、可重復的特點，可用于溪黃草藥材及含溪黃草的復方制劑的質(zhì)量控制。

【關鍵詞】溪黃草；6,7去氫羅伊林酮；(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基-8,11,13松香烷7酮；含量測定；反相高效液相色譜法

Abstract：ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofditerpenoidsindifferentbatchesoftheaerialpartofIsodonlophanthoidesvar.gerardianus.MethodsAnRPHPLCmethodwasestablishedforthedeterminationof6,7Dehydroroyleanoneand(15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7onebyusingKromasilRPC18(250mm×，5μm)column,withamixtureof%trifluoroaceticacidAcetonitrile(25∶75)asmobilephaseattheflowrateofml·min-1anddetectionwavelengthof210contentsoftheabovetwoditerpenoidsshowedgreatdifferenceamongthe11patchesoftestedsamples.Thecontentof6,7Dehydroroyleanonerangedfromtoμg·g-1andthatof(15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7onerangedfromtoμg·g-1.Thesuggestedcontentlimitationof6,7-Dehydroroyleanoneshouldbeμg·g-1,andthatof(15S)12,16Epoxy-11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7onebeμg·g-1inthecrudeIsodonlophanthoidesestablishedmethodhasbeenprovedtobesimple,stableandrepeatable,andcanbeappliedforqualitycontrolofthecrudeIsodonlophanthoidesandcompoundprescriptionscontainedcrudeIsodonlophanthoides

Keywords：Isodonlophanthoides；6,7Dehydroroyleanone；(15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one；Contentdetermination；RPHPLC

溪黃草為唇形科香茶菜屬植物狹基線紋香茶菜IsodonserraHara的干燥全草，具有清熱利濕、退黃、涼血散淤之功效，是我國南方地區(qū)治療乙型肝炎的常用草藥［1］，臨床應用廣泛，療效確切，目前已有較多的以其為主要原料的養(yǎng)肝護肝中藥制劑及保健品。該植物主要含有松香烷型二萜類及烏索烷型三萜類成分(Ursanetype)［2］，迄今為止國內(nèi)外學者報道已從中分離得到13種二萜和4種烏索烷型三萜，其中6個松香烷型二萜分別為狹基線紋香茶菜甲素、乙素，11βhydroxyl8，15isopimaradiene3one、GerardianinA，GerardianinB，Lophanicacid，1個半日花烷型二萜即8(17),12,14Labdatriene19oicacid及6個二萜醌分別為16Acetoxy7Oacetylhorminone，16Acetoxy12Oacetylhorminone，Royleanone，6,7-Dehydroroyleanone，Horminone，16Acetoxy7αmethoxyroyleanone；Ursolicacid，Oleanacid，2αhydroxylUrsolicacid，2α,19αdihydroxylUrsolicacid等成分。有關溪黃草三萜類成分如熊果酸、2α羥基熊果酸［3，4］的含量測定，我們已有報道。然而對其所含成分種類眾多、抗腫瘤活性作用［5，6］成分的測定，國內(nèi)外尚無文獻報道。我們通過前期系統(tǒng)的化學成分研究，分離純化了兩個二萜化合物6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮，并收集了廣東地區(qū)市售商品藥材，測定這兩個二萜化合物的含量，以期為溪黃草質(zhì)量體系的建立和完善提供科學依據(jù)。

1器材

依利特P230雙泵高效液相色譜儀(大連伊利特)，EC2000色譜工作站；Satorius電子分析天平。所用試劑均為分析純，液相用乙腈為色譜純，水為市售純凈水。溪黃草均為市售，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學陳建南研究員鑒定學名為Isodonlophanthoides。

6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮對照品為自制，并經(jīng)光譜學鑒定及色譜法檢測其純度為99%以上。液相色譜純試劑為MERCK公司出品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1溪黃草藥材樣品資料

2方法與結(jié)果

色譜條件KromasilRPC18色譜柱；流動相：乙腈%三氟乙酸；流速:：ml/min;檢測波長：210nm;進樣量：5μl；理論塔板數(shù)按6,7去氫羅伊林酮計算應不低于6000，按(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基-8,11,13松香烷7酮計算應不低于5000。6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的保留時間分別為min和min并且與其它組分分離良好。對照品和樣品的高效液相色譜圖見圖1～2。

a：6,7去氫羅伊林酮

b：(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮

圖16,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基-8,11,13松香烷7酮的HPLC分離圖譜

圖2溪黃草藥材的HPLC分離圖譜

標準曲線的制備及線性范圍考察精密稱取6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮對照品適量,加甲醇溶解并定溶,制成濃度分別為420μg/ml,360μg/ml的儲備液。分別精密量取一定體積的儲備液于量瓶中,稀釋成系列濃度的對照品溶液,6,7去氫羅伊林酮稀釋體積為→10ml，→2ml，→2ml，.2→2ml，→2ml，→2ml，ml→2ml，加甲醇稀釋到刻度,搖勻；XHC－5稀釋體積為ml→10ml，→2ml，→2ml，→2ml，→2ml，→2ml，ml→2ml,加甲醇稀釋到刻度,搖勻,備用。分別精密吸取上述系列濃度的對照品溶液各5μl,依選定色譜條件進行測定,以峰面積(Y)對對照品質(zhì)量(X)進行線性回歸,得回歸方程分別為:6,7去氫羅伊林酮：Y=，r=3,線性范圍：～525ng；(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮：Y=+,r=9,線性范圍：9～450ng。

樣品溶液的制備精密稱取溪黃草藥材g，加甲醇80ml索氏提取至餾出液為無色，提取液水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解并定容至10ml，備用，進樣前以μm的微孔濾膜過濾。

穩(wěn)定性實驗精密吸取樣品溶液10μl，分別于0，1，2，4，8，12，24h進行測定。結(jié)果見表2。

表2穩(wěn)定性實驗結(jié)果

結(jié)果表明樣品溶液放置24h內(nèi)穩(wěn)定，故宜在24h內(nèi)完成測定。

精密度實驗精密吸取樣品溶液10μl，連續(xù)進樣5次。結(jié)果見表3。

表3精密度實驗結(jié)果

重現(xiàn)性實驗精密稱取溪黃草樣品5份，余同項下操作，進樣前以μm微孔濾膜過濾。結(jié)果見表4。

表4重現(xiàn)性實驗結(jié)果

加樣回收率精密稱取同一已知6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮含量的溪黃草樣品適量，再準確加入6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮對照品，余同項下操作，進樣10μl，記錄色譜圖并計算結(jié)果。結(jié)果見表5。

表56,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮加樣回收率結(jié)果

樣品含量測定精密稱取11批次溪黃草1g，余下操作同項下操作，進樣10μl，記錄色譜圖并計算結(jié)果。結(jié)果見表6。

表6溪黃草中6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮含量測定結(jié)果

3討論

有關溪黃草的質(zhì)量分析，多為對其中三萜類成分的含量測定［3，4］，然而大量文獻報道該藥材主要含有二萜類成分，且該類成分也是其抗腫瘤活性的主要有效成分。因此，建立以有效成分群二萜類成分為溪黃草的質(zhì)量控制體系，更能真實客觀地反映其內(nèi)在質(zhì)量。我們在化學成分研究的基礎上，建立針對溪黃草中的二萜成分的含量測定方法，并對所收集的11批次商品藥材進行質(zhì)量分析，以期為建立專屬、可行的溪黃草質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

采用RPHPLC法，對11批次的溪黃草提取物中的6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基-8,11,13松香烷-7-酮進行測定，11批次的測試樣品中6,7-去氫羅伊林酮的含量范圍在～μg·g-1，(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的含量范圍在～μg·g-1。

通過對6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的紫外全波長掃描，可知兩個對照品的紫外最大吸收均在210nm。因此，本實驗選擇210nm作為6,7去氫羅伊林酮和(15S)12,16環(huán)氧11,14二羥基8,11,13松香烷7酮的檢測波長，以保證這兩個化合物在HPLC中有較高的響應值及靈敏度。

對流動相系統(tǒng)經(jīng)過反復多次的試驗和摸索，曾嘗試用甲醇－水、乙腈水、甲醇%醋酸、乙腈%醋酸、乙腈%三氟醋酸等系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在210nm下，甲醇－水系統(tǒng)的基線噪音較嚴重，而乙腈系統(tǒng)較好。乙腈水系統(tǒng)基線漂移較嚴重，加%醋酸有所改善，但6,7去氫羅伊林酮在此條件下很難洗脫，換成%三氟醋酸，兩組分的峰形得到較好改善，也有較好的分離度。最終確定乙腈%三氟醋酸為溪黃草提取物中二萜成分含量測定的流動相系統(tǒng)。經(jīng)過系統(tǒng)的方法學考察，所建立的方法具有穩(wěn)定、簡便、可重復的特點，可用于溪黃草提取物工藝的質(zhì)量控制。

【參考文獻】

［1］吳劍峰.溪黃草的研究綜述［J］.時珍國醫(yī)國藥，2003,14(8)：498.

［2］孫漢董,許云龍