目錄研究背景研究目的研究內(nèi)容我國乳糖不耐受人群的調(diào)查高水解率低乳糖牛奶的開發(fā)高水解率低乳糖牛奶對乳糖不耐受的干預(yù)試驗該項研究得到的支持和相關(guān)評價研究背景很多人由于小腸上皮細胞乳糖酶缺乏，飲用牛奶后乳糖不能被分解吸收，乳糖進入結(jié)腸后被腸道細菌分解，產(chǎn)生大量乳酸、甲酸等短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，使腸腔中的水分增多，引起腹脹、腸鳴、腸絞痛直至發(fā)生腹瀉等癥狀，這種現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上稱為乳糖不耐受癥。除表現(xiàn)為乳糖不耐癥者外，還存在乳糖代謝不良但不表現(xiàn)為癥狀的人群，本研究中稱之為乳糖吸收不良者。 乳糖不耐受癥與乳糖吸收不良（不表現(xiàn)為癥狀但乳糖代謝不良）合稱為乳糖酶缺乏。研究背景乳糖酶缺乏在歐洲北部后代中占15%,黑人及拉丁人群占80%,而美國印第安人和亞洲人可高達100%

--SwagertyDLJr.,WallingAD,KleinRM.Lactoseintolerance[J].AmFamPhysician,2002,65(9):1855-1856.6-10歲亞洲兒童的乳糖不耐受85-100%---QuakSH.LactoseintoleranceinAsianchildren.JPaediatrChildHealth1994;30:91–2.楊月欣教授研究了中國兒童乳糖不耐受癥的發(fā)生率，結(jié)果表明3-5歲、7-8歲、11-13歲組兒童中，乳糖不耐受發(fā)生率分別為12.2%、32.2%、和29.0%，乳糖酶缺乏發(fā)生率分別為38.5%、87.6%、87.8%--衛(wèi)生研究，Vol.28,No.1,1999。肖玉樺等人的調(diào)查結(jié)果表明我國健康成人的乳糖酶缺乏率高達92%--現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，Vol.26,No.1,1999;

有如此高的比例嗎？研究背景分別給成人受試者50、25、12.5g乳糖，乳糖酶缺乏率分別為100%、86.4%、59.1% ---新醫(yī)學(xué)，1988，Vol.19：512；分別給成人受試者25、12.5、6.25g乳糖，乳糖酶缺乏率分別為85%、48.9%、2%;---中國藥學(xué)雜志，1998，Vol.33，No.5分別給受試者（7-18歲）25、12.5、6.25g乳糖，乳糖酶缺乏率分別為79.3%、19.7%、7.2%;

---中國學(xué)校衛(wèi)生，2002，Vol.23，No.2

乳糖酶缺乏率、不耐受癥狀發(fā)生率受乳糖攝入量的影響研究目的有必要根據(jù)年齡，設(shè)計每次攝入牛奶的適宜量，通過飲用適宜量的牛奶，篩查得到乳糖酶缺乏數(shù)據(jù)和乳糖不耐受數(shù)據(jù)。這一數(shù)據(jù)對于生活習(xí)慣和健康的關(guān)系最大；在此基礎(chǔ)上，研究如何滿足乳糖酶缺乏和乳糖不耐受消費者飲用牛奶的需要。

研究內(nèi)容我國乳糖不耐受人群的調(diào)查高水解率低乳糖牛奶的開發(fā)高水解率低乳糖牛奶對乳糖不耐受的干預(yù)試驗我國乳糖不耐受人群的調(diào)查伊利集團聯(lián)合中科院生物物理所中生金域診斷技術(shù)有限公司、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)、西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院少兒衛(wèi)生教研室、中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會鈣工程專業(yè)委員會對北京、哈爾濱、西安三大城市3-70歲的人群通過飲奶，進行乳糖不耐受調(diào)查。我國乳糖不耐受人群的調(diào)查

試驗方法：測試前兩天至測試結(jié)束前，受試者禁止飲奶及奶制品；測試前一天至測試結(jié)束前，受試者禁食大量水果（一天250克以上）；測試當(dāng)天早晨，要求受試者不進食、不飲水，空腹到測試現(xiàn)場參加測試。將1490名志愿者按年齡段分為6組，每組飲用不同數(shù)量的純牛奶（乳糖含量為4.8%）。受試者一次飲完液態(tài)純牛奶，同時吃完現(xiàn)場配送的面包，飲奶后至測試結(jié)束前，不得再飲水、進食，飲奶后1小時排空尿液，飲奶后2小時收集尿液，然后用中生金域診斷技術(shù)有限公司的尿半乳糖試劑盒測定被調(diào)查人群的乳糖耐受情況。我國乳糖不耐受人群的調(diào)查分組情況和飲奶量3-4歲125ml5-6歲250ml7-9歲300ml10-12歲350ml13-17歲400ml≥18歲450ml我國乳糖不耐受人群的調(diào)查乳糖耐受能力的評價標準測定結(jié)果飲奶后的癥狀乳糖耐受能力陰性無消化道癥狀乳糖耐受陽性無消化道癥狀乳糖吸收不良陽性有腹痛、腹部不適、惡心、腹脹、腹瀉一項乳糖不耐受癥陽性（乳糖吸收不良、乳糖不耐受癥）統(tǒng)稱為乳糖酶缺乏我國乳糖不耐受人群的調(diào)查年齡（歲）例數(shù)正常乳糖酶缺乏例數(shù)（發(fā)生率）乳糖吸收不良乳糖不耐受癥X2P3-417312152（30.0%）45（26.0%）7(4.0%）5－61509060（40.0%）42（28.0%）18(12.0%）0.7747－1022415173（32.6%）58（25.9%）15(6.7%）0.13111－141448460（41.6%）42（29.2%）18(12.5%）2.13815－17793247（59.5%）39（49.4%）8(10.1%）6.495＜0.0118－40399156243（60.9%）174（43.6%）69(17.3%）0.07641－70321107214（66.7%）143（44.5%）71(22.1%）2.3363-701490701749(50.2%)543(36.4%)206(13.8%)不同年齡組牛奶乳糖不耐受的檢出情況飲奶狀況例數(shù)乳糖酶缺乏例數(shù)（發(fā)生率）乳糖吸收不良乳糖不耐受癥經(jīng)常飲奶573291（50.8%）223（38.9％）68（11.9％）不常飲奶740391（52.8%）270（36.5％）121（16.4％）我國乳糖不耐受人群的調(diào)查經(jīng)常飲奶誘導(dǎo)不了乳糖酶活性，癥狀可弱化--衛(wèi)生研究，Vol.28,No.1,1999。乳糖酶為非誘導(dǎo)酶

---NewcomerAD,McGillDB.Gastroenterology,1967,53(6):881-889.乳糖酶缺乏受遺傳影響？乳糖酶基因位于2號染色體長臂(2q21)，酶蛋白先是由小腸上皮細胞合成一個220KD的前體物,然后再繼續(xù)加工剪切成180KD的成熟酶蛋白。多數(shù)研究認為：斷奶后乳糖酶活性的下降不依賴于膳食中乳糖的存在,多項研究均證明乳糖的攝入并不能維持或增強乳糖酶的活性,因此進食乳糖并不能抑制基因決定的乳糖酶的表達

。芬蘭兒童對牛奶過敏與其基因型為C/C-13910相關(guān),其成人型乳糖酶活性低下也與該基因型相關(guān)

。有研究表明我國北方5個少數(shù)民族的乳糖不耐受和該基因在該處的變異關(guān)系不大。還有一種乳糖不耐受也可由腹瀉導(dǎo)致。但一般可以在腹瀉癥治愈后恢復(fù)。研究內(nèi)容我國乳糖不耐受人群的調(diào)查高水解率低乳糖牛奶的開發(fā)高水解率低乳糖牛奶對乳糖不耐受的干預(yù)試驗高水解率低乳糖牛奶的開發(fā)乳糖酶的選擇乳糖水解率快速方法的開發(fā)低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定低乳糖牛奶在貨架期內(nèi)的褐變情況乳糖酶的選擇目前僅來源于微生物的β－半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價值，不同微生物來源的β－半乳糖苷酶的性質(zhì)有所不同。考慮安全性、經(jīng)濟性以及適應(yīng)性，最終選擇來源于乳酸克魯維酵母產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶。乳糖酶的選擇隨著反應(yīng)溫度的升高，乳糖酶催化乳糖的水解率增加。當(dāng)達到一定溫度時，溫度再升高，乳糖酶催化乳糖的水解率就開始降低。從圖中可以得到，該酶的最適反應(yīng)溫度為39-41℃。乳糖酶最適反應(yīng)溫度的確定乳糖酶的選擇pH值低于6.5時，酶活力隨著pH值的下降迅速降低，pH值在6.5-7.0時活性達到最大值。該酶的最適反應(yīng)pH值為6.5-7.0，該酶最適pH值恰好在鮮乳的天然pH

值之間，因此適合鮮奶的水解。

乳糖酶最適反應(yīng)pH值的確定冰點法低乳糖牛奶產(chǎn)品的水解率是衡量其乳糖水解程度的一項重要的生產(chǎn)指標。用HPLC法測定乳糖需要昂貴的儀器，不便于工廠使用。為了探尋一種適合于低乳糖牛奶生產(chǎn)中檢測分析需要的簡便快捷的新方法，開發(fā)了冰點法，利用冰點降低幅度可以測定牛奶乳糖水解率。得出較準確的冰點公式為X=(ΔΤ+0.5601)/-0.2907方法特點：節(jié)省檢測時間，節(jié)約檢測成本。HLPC每測定一個樣子，費用在200元。而冰點儀每開一次機進行校正的費用僅為12元，可以測定幾十個樣品。乳糖水解率快速方法的開發(fā)乳糖水解率快速方法的開發(fā)葡萄糖氧化酶—分光光度法牛奶中1分子的乳糖水解成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖，通過測定葡萄糖的量就可以得到已水解的乳糖量。測定原理如下：β-D葡萄糖+O2+H2OD-葡萄糖酸+H2O2

H2O2+4-AAP+苯酚紅色醌化物+H2O1ml乳糖水解牛奶稀釋到10ml，取20μL到葡萄糖酶試劑與苯酚試劑等體積混合液，加好試劑后置37℃恒溫水浴反應(yīng)20min，在505nm波長處測定吸光度值并計算葡萄糖濃度。PODGOD乳糖水解率快速方法的開發(fā)將低乳糖牛奶分兩份，一份直接測葡萄糖，另一份加入10000NLU/L的乳糖酶置于39℃的環(huán)境中反應(yīng)2小時充分水解牛奶重殘余乳糖，然后測定葡萄糖的濃度。乳糖水解率的計算公式乳糖水解率=×100%葡萄糖氧化酶—分光光度法乳糖水解率快速方法的開發(fā)12345樣品吸光度值0.2470.3630.5080.6200.736實際加入量（g/L）1.0181.5042.0212.5073.016試驗中測得的量(g/L)0.9881.4252.0322.4802.944回收率(%)97.0596.54100.5498.9297.61葡萄糖氧化酶法準確度試驗乳糖水解率快速方法的開發(fā)葡萄糖氧化酶法精密度試驗

123456平均值標準偏差變異系數(shù)水解的樣品吸光度值0.3340.3390.3440.3510.3460.342———牛奶中水解了的乳糖含量（g/100mL）2.6722.7122.7522.8082.7682.7362.7410.0471.7%完全水解樣品吸光度值0.6180.6510.6470.6450.6540.654———牛奶中乳糖完全水解的含量即牛奶水解前乳糖的含量(g/100mL)4.9445.2085.1765.1605.2325.2325.1590.1092.1%乳糖水解率（%）53.13低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定

流程1：原料奶殺菌冷卻到最適溫度加酶攪拌水解UHT冷卻包裝低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定隨著反應(yīng)時間的延長，添加不同濃度乳糖酶的牛奶的水解率在增加，當(dāng)水解率超過80%以上，乳糖的水解率趨于平緩。乳糖水解率達到70%就可以解決乳糖不耐受的癥狀，綜合考慮，在最適反應(yīng)溫度下水解牛奶中乳糖的最佳工藝條件是酶的添加量為1500NLU/L，水解時間2小時。最適溫度（39℃）下乳糖水解率隨時間的變化低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定流程2：原料奶巴氏殺菌（85℃，15S）冷卻到（4℃）加酶攪拌水解UHT冷卻包裝低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定經(jīng)過12小時，添加2000NLU/L乳糖酶的巴氏殺菌牛奶的水解率達到70%以上。在低溫下水解牛奶中的乳糖的最佳工藝條件為添加2000NLU/L的乳糖酶放置一個班次的時間。低溫下乳糖水解率隨時間的變化低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定流程3：原料乳殺菌(UHT)冷卻到15℃灌裝包裝水解無菌添加乳糖酶無菌乳糖酶的制備

采用膜過濾技術(shù)進行原料除菌，使產(chǎn)品在無菌添加時不會受到二次污染。采用膜過濾可以使酶活力損失降低至最小，最大限度地保持酶制劑活力，同時能保證乳糖酶的顏色呈現(xiàn)透明色。首先將乳糖酶通過無菌膜除去雜質(zhì)和微生物，加工成無菌包裝的乳糖酶，然后通過無菌在線添加設(shè)備將無菌袋包裝的乳糖酶直接添加到無菌罐或者無菌灌裝機中。低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定

在線無菌添加的實現(xiàn)無菌添加工藝采用高溫高壓蒸汽作為產(chǎn)品的保護屏障，在無菌酶制劑添加到產(chǎn)品的過程中始終保持一個雙向無菌的環(huán)境狀態(tài)，從而保證產(chǎn)品、酶制劑的無菌性，防止產(chǎn)品免受二次污染。在整個無菌酶制劑的添加過程中，產(chǎn)品和酶制劑的溫度保持在20－25℃的溫度下。低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定添加250,500,750NLU/L的乳糖酶，經(jīng)一周后乳糖水解率均達到90%以上。一般UHT奶經(jīng)一周檢驗合格后才投放市場，當(dāng)產(chǎn)品到達消費者手中時，乳糖可以完全水解，無菌添加的最佳工藝為添加250NLU/L，貯存一周。無菌添加乳糖水解率隨時間的變化低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定

三種工藝的比較分別對三種工藝流程進行試驗，發(fā)現(xiàn)使用流程1時，乳糖水解率達到70%時所需的時間短，但牛奶容易遭受微生物的污染，而且水解出的牛奶經(jīng)過超高溫滅菌后，有明顯的褐變；流程2雖然可以減少微生物的污染，但所需的酶的用量大，水解出的牛奶經(jīng)過超高溫滅菌后，也容易褐變；流程3是在牛奶超高溫滅菌后罐裝的同時加入乳糖酶，該工藝不會引起低乳糖牛奶的微生物污染和褐變，并且所需酶的用量少，可生產(chǎn)出乳糖水解率≥90%的低乳糖牛奶，能降低低乳糖牛奶的生產(chǎn)成本；最終選擇工藝流程3來生產(chǎn)高水解率的低乳糖牛奶。低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝的確定工藝流程3優(yōu)點普通工藝添加乳糖酶不僅需要大量添加乳糖酶，同時還需要很長的工藝時間來水解乳糖，耗時耗電，水解的產(chǎn)品經(jīng)加工后容易發(fā)生褐變，縮短產(chǎn)品貨架期。利用無菌在線添加技術(shù)極大地降低了乳糖酶的使用成本，同時防止產(chǎn)品在貨架期內(nèi)發(fā)生褐變，延長了產(chǎn)品的貨架期，貨架期可以達到7個月。用此工藝巧妙地利用了待檢時間完成水解，使工藝操作中省去了水解時間，對于90％的乳糖水解率，酶用量減少為原來的四分之一，極大地提高了工廠的利用率，降低了生產(chǎn)成本和管理費用。低乳糖牛奶在貨架期內(nèi)的褐變情況牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)和還原糖，在熱處理過程中易發(fā)生美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)是氨基化合物（胺、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)）和羰基化合物（糖類）自然發(fā)生的反應(yīng)，也稱之為非酶褐變。在牛奶中主要是還原糖的羰基和乳蛋白質(zhì)中賴氨酸的ε-氨基結(jié)合，發(fā)生美拉德反應(yīng)，并最終生成褐色物質(zhì)。低乳糖牛奶的生產(chǎn)過程中，乳糖被分解成為葡萄糖和半乳糖。由于褐變反應(yīng)速度與糖的種類有關(guān)，六碳糖比雙糖更容易發(fā)生反應(yīng)，再加上低乳糖牛奶中還原糖數(shù)量的增加，所以低乳糖牛奶比普通牛奶更容易發(fā)生褐變。本實驗以初級美拉德反應(yīng)中3-脫氧葡糖醛酮的降解產(chǎn)物HMF（羥甲基呋喃）作為褐變標志物，測定無菌添加乳糖酶的低乳糖牛奶在室溫貯存期內(nèi)的褐變情況。UHT奶在25℃經(jīng)5個月的貯存HMF幾乎沒有增加，無菌添加乳糖酶的UHT乳在同樣條件下貯存，雖然HMF從43.16μmol/L增加到73.09μmol/L，但用肉眼觀察不出它的顏色變化，經(jīng)過7個月的貯存在顏色上仍與UHT乳無差別。而先水解后超高溫滅菌的低乳糖牛奶（水解率≥70%）在生產(chǎn)出來時HMF就達到了120.26μmol/L，用肉眼已經(jīng)觀察到它的顏色發(fā)生變化。所以選擇無菌后添加乳糖酶的工藝生產(chǎn)低乳糖牛奶可解決褐變問題，并延長貨價期。低乳糖牛奶在貨架期內(nèi)的褐變情況低乳糖牛奶在貨架期內(nèi)的褐變情況貯存一個月顏色的變化貯存七個月顏色的變化研究內(nèi)容我國乳糖不耐受人群的調(diào)查高水解率低乳糖牛奶的開發(fā)高水解率低乳糖牛奶對乳糖不耐受的干預(yù)試驗乳糖不耐受的干預(yù)試驗伊利集團聯(lián)合北京中生金域診斷技術(shù)有限公司、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)、西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院少兒衛(wèi)生教研室、中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會鈣工程專業(yè)委員會進行了乳糖不耐受的干預(yù)試驗。乳糖不耐受的干預(yù)試驗經(jīng)乳糖耐受試驗篩查出的乳糖吸收不良者和乳糖不耐受者作干預(yù)試驗。受試者飲用低乳糖牛奶，試驗方法、不同年齡組飲奶量同耐受試驗。試驗方法：乳糖不耐受的干預(yù)試驗干預(yù)效果評價標準顯效： 消化道癥狀消失、尿半乳糖試驗轉(zhuǎn)為正常。有效： 消化道癥狀減輕、尿半乳糖試驗轉(zhuǎn)為正?；騿雾椖虬肴樘窃囼炥D(zhuǎn)為正常。乳糖不耐受的干預(yù)試驗本次研究采用內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司研制的高水解率低乳糖牛奶（乳糖水解率≥90%），對468例乳糖吸收不良和152例乳糖不耐受癥者進行干預(yù)。乳糖不耐受的干預(yù)試驗

乳糖吸收不良乳糖不耐受癥年齡例數(shù)有效例數(shù)有效顯效＜7106102（95.3%）2927（93.1%）27（93.1%）7－17122119（97.6%）3938（97.4%）34（87.2%）18－40145139（95.1%）5250（96.0%）48（82.7%）41－709592（96.7%）3231（96.8%）28（87.5%）合計468452（96.6%）152146(96%)137(90.1%)腹脹多屁腹部不適腹痛腹瀉例數(shù)6254673544有效60（96.8%）52（96.3%）50（74.6%）33（94.3%）43（97.7%）表2低乳糖牛奶對乳糖不耐受的改善結(jié)果

表3低乳糖牛奶對乳糖不耐受臨床癥狀的改善效果研究發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新本項目在國內(nèi)第一次通過給受試者根據(jù)年齡確定飲奶量，在北方3大城市進行了2000多例乳糖不耐受篩查試驗，得到了50.6%的國人乳糖酶缺乏的結(jié)果；本項目開發(fā)了乳糖水解率大于90%的UHT低乳糖液態(tài)奶--營養(yǎng)舒化奶系列產(chǎn)品。產(chǎn)品技術(shù)特點：1）該產(chǎn)品水解率大于90%，國內(nèi)首創(chuàng)；2）解決了低乳糖牛奶生產(chǎn)過程容易發(fā)生褐變的問題，國內(nèi)首創(chuàng)；3）第一次在乳品行業(yè)采用無菌添加酶工藝，國內(nèi)首創(chuàng)；4）采用UHT技術(shù)，保質(zhì)期7個月，國內(nèi)首創(chuàng)；5）酶解過程無污染，用酶省，工藝技術(shù)經(jīng)濟性好；6）該項目已順利的完成大規(guī)模、流水線的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。7）舒化奶配方中合理的添加膳食纖維和膠原蛋白，更貼近中國人膳食營養(yǎng)需求。本項目在國內(nèi)第一次采用高水解率低乳糖牛奶--營養(yǎng)舒化奶，在多個城市進行了乳糖吸收不良人群飲用低乳糖牛奶的干預(yù)試驗，結(jié)果表明，本項目開發(fā)的產(chǎn)品營養(yǎng)舒化奶改善乳糖吸收不良的有效率為96.6%，對乳糖不耐受癥改善的有效率和顯效率分別為96%和90.1%。本項目研究過程中還開發(fā)了2種乳糖水解率快速檢測方法。

相關(guān)資料產(chǎn)品相關(guān)標準的編寫標準名稱標準編號滅菌低乳糖奶（包括全脂和低脂）Q/NYLA44-2006該項研究完成后，伊利集團申請了低乳糖奶國家標準的立項，并且已經(jīng)納入國標委2007年第四批國家標準制修訂計劃。伊利集團作為起草單位，承擔(dān)了該項目，項目編號為：20071103-T-469。..\..\..\創(chuàng)新型企業(yè)\2007年申報材料\第二輪申報\國家標準化管理委會批準的第四批標準.xls專利和文章申請的專利：發(fā)明名稱申請?zhí)栆环N測定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法200710007145.4一種低乳糖奶的制備方法200710000802.2發(fā)表的文章：1卜建斌,云戰(zhàn)友,邢黎明.β-半乳糖苷酶的應(yīng)用及固定化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）,2006,(2):4-6.2卜建斌,云戰(zhàn)友.低乳糖牛奶生產(chǎn)工藝研究[C].中國奶業(yè)協(xié)會年會論文集(2007)