淺論低O2高CO2對(duì)小鼠血腦屏障及水通道蛋白【摘要】目的：探討低O2高CO2對(duì)小鼠血腦屏障通透性、超微結(jié)構(gòu)及水通道蛋白-4表達(dá)的影響。方法：雄性成年C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(低O2高CO21d、2d、3d、1周、2周組)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物置于低O2高CO2艙造模。小鼠腹腔注射熒光素鈉，觀察不同時(shí)間點(diǎn)血腦屏障通透性的變化，電鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化，免疫組化及RT-PCR分別檢測(cè)小鼠前額葉皮層及海馬AQP4蛋白及mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)1d組小鼠血腦屏障的通透性升高最明顯，然后逐漸下降，在1周內(nèi)仍顯著高于對(duì)照組，2周末回落至對(duì)照組水平。實(shí)驗(yàn)1d組小鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)有明顯改變，皮層及海馬腦組織AQP4蛋白及mRNA表達(dá)顯著增高。結(jié)論：低O2高CO2在早期能使小鼠血腦屏障的通透性升高，可能與AQP4的表達(dá)增高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】血腦屏障；低氧；高碳酸血癥；水通道蛋白-4：星形膠質(zhì)細(xì)胞；小鼠

Abstract:Objective:Toinvestigatethechangesofthepermeabilityandultrastructureofmice’sblood-brainbarrier(BBB)andexpressionofaquaporin-4(AQP4)causedbyhypoxichypercapnia.Methods:ThemaleadultC57BL/6micewererandomlydividedintosixgroups:thecontrolgroup(C)，thehypoxichypercapnia1d，2d，3d，1wand2wgroup.Experimentalmicewereexposedtonormobarichypoxichypercapniabyplacingtheminachamber.Sodiumfluorescein(NaFI)wasinjectedintraperitoneallytodetectthepermeabilityofBBB.TheBBBultrastructurewasobservedbyelectronmicroscope.TheexpressionofAQP4mRNAandproteinlevelsweremeasuredbyImmunochemistryandPT-PCR.Results:ComparedwithCgroup，thepermeabilityofmice’sBBBincreasedsignificantlyin1d，2d，3dand1wgroup，whichdeclinedgraduallywiththeprolongationofhypoxichypercapnicexposureandhadnosignificantincreasein2wgroup.BBBultrastructurechangeswereobservedbyelectronmicroscopeandmRNAandproteinofAQP4wereupregulatedsignificantlyin1dgroup().Conclusion:Theblood-brainbarrier’spermeabilitymayincreasewithmice’sexposuretohypoxichypercapniaatearlystage，whichmayhavetherelationshiptotheupregulaionofAQP4.

Keywords:blood-brainbarrier；hypoxia；hypercapnia；aquaporin-4；astrocyte；mouse

血腦屏障功能的調(diào)節(jié)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突密切相關(guān)[1]。水通道蛋白4是一種跨膜蛋白，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突上呈極化表達(dá)，是水分進(jìn)出星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要通道之一。以往的研究證明，在慢性低O2高CO2條件下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知功能發(fā)生損害，其是否與血腦屏障的破壞有關(guān)，鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立低O2高CO2小鼠模型，研究血腦屏障的變化及其與AQP4的關(guān)系。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模雄性C57BL/6小鼠，10周齡，體重22～27g，共64只，溫州醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照、實(shí)驗(yàn)1d、2d、3d、1周、2周組。將實(shí)驗(yàn)組小鼠置于常壓低O2高CO2艙內(nèi)，通過氮?dú)庹{(diào)節(jié)艙內(nèi)O2濃度，使其維持在9%～11%，通入CO2使其濃度維持在5%～6%，每天8h，其余時(shí)間與對(duì)照組置于同一室內(nèi)。

透過血腦屏障熒光素鈉測(cè)定參照Olsen等的方法，對(duì)照組及出艙小鼠即刻注射10%NaFI，mL，45min后處死。4%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，血標(biāo)本4℃靜置約30min，4500r/min離心10min，取上清。打開胸腔，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，右心房剪口，生理鹽水灌注，直至右心房流出清亮液體為止。斷頭取腦，腦組織加入mLPBS勻漿，3000r/min離心5min，取上清。血清樣品與腦樣品用20%TCA1:10稀釋，4℃孵育24h后，樣品10000r/min離心15min，取上清，用同體積的Tris-Hcl緩沖液稀釋。測(cè)熒光強(qiáng)度。血腦屏障通透性用每克腦組織中NaFI含量與每mL血清中NaFI含量的比值來測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線用已知NaFI含量的含10%TCA與MTris緩沖液的腦組織勻漿上清液來繪制。

電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察取實(shí)驗(yàn)1d組與對(duì)照組小鼠，用4%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，4%新鮮配制的多聚甲醛灌注固定，待鼠體僵硬，冰盤上大腦皮質(zhì)修塊約1mm3大小，浸泡于%的戊二醛，24h后，1%鋨酸后固定，系列丙酮梯度脫水，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片，常規(guī)染色，H-7500型透射電鏡觀察。

免疫組化測(cè)定AQP4蛋白取實(shí)驗(yàn)1d組與對(duì)照組小鼠，先生理鹽水灌注，后4%多聚甲醛灌注固定。從視交叉處腦組織冠狀切，置于4%多聚甲醛后固定，脫水包埋，制作4μm厚的石蠟切片。組織切片經(jīng)脫蠟至水，高溫高壓修復(fù)4min，3%的過氧化氫除內(nèi)源性過氧化酶，分別加兔抗AQP4(1∶200，美國(guó)santacruz公司)4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育30min后，DAB顯色(DAB及二抗購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司)，蘇木素復(fù)染、透明、封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。顯微鏡下棕黃染色為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片選皮層、海馬各3個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，計(jì)算平均光密度值。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)AQP4mRNA取實(shí)驗(yàn)1d組與對(duì)照組小鼠，用TRIzol提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司提供)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA加入AQP4引物，用TakaraTaq酶擴(kuò)增，以MBA為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，AQP4和MBA均為31次循環(huán)，最后72℃延伸5min。AQP4引物上游序列為5’-TCTTTTGGACCCGCAGTTAT-3’，下游序列為5’-CCACTTGGCTCCGGTTGT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為214bp；MBA引物上游序列為5’-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3’，下游序列為5’-GGATTCCATACCCAAGAAGGAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為470bp。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為115%的瓊脂糖凝膠證實(shí)，測(cè)定其A值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參照的A值比。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法多組間比較采用單因素方差分析；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

血腦屏障通透性變化低O2高CO2能使小鼠血腦屏障的通透性快速增高，1d組升高最明顯，然后逐漸下降，在1周內(nèi)仍顯著高于對(duì)照組，2周末才回落至對(duì)照組水平。

電鏡觀察對(duì)照組小鼠血腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整光滑，細(xì)胞間有緊密連接存在，表現(xiàn)為相鄰細(xì)胞間深染致密條帶，內(nèi)皮細(xì)胞外基膜連續(xù)。周圍腦組織未見病理改變。實(shí)驗(yàn)1d組，大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞吞飲泡增多，基底膜疏松密度不均，緊密連接松弛，膠質(zhì)細(xì)胞足突腫脹。周圍神經(jīng)纖維部分腫脹。

AQP4免疫組化蛋白表達(dá)AQP4蛋白在對(duì)照組小鼠腦前額葉皮質(zhì)及海馬呈陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)1d組AQP4蛋白表達(dá)增多，染色增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異有顯著性。

AQP4mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)1d組AQP4mRNA表達(dá)升高，與對(duì)照組比較差異有顯著性。

3討論

血腦屏障是位于腦與血液之間的屏障，對(duì)于維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的低氧、炎癥及變性等，都會(huì)引起血腦屏障的破壞。熒光素鈉是一種小分子熒光示蹤劑，分子量376D，正常情況下不能透過血腦屏障。本試驗(yàn)顯示，低O2高CO2能使小鼠血腦屏障的通透性快速增高，1d組升高最明顯，然后逐漸下降，在1周內(nèi)仍顯著高于對(duì)照組，2周末才回落至對(duì)照組水平。電鏡下實(shí)驗(yàn)1d組小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突水腫明顯，基底膜疏松，血管內(nèi)皮的緊密連接變得松弛，也顯示了低O2高CO2對(duì)小鼠血腦屏障的結(jié)構(gòu)損害。以上結(jié)果表明，低O2高CO2引起的血腦屏障的破壞主要是在早期，可能由于反復(fù)常氧間歇及對(duì)低氧的適應(yīng)，血腦屏障存在修復(fù)代償，其機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

AQP4是腦組織中含量最多的水通道蛋白，是水分進(jìn)出腦組織的主要通道，它在緊貼微血管與室管膜上皮的星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突上的極化表達(dá)，提示它在水分進(jìn)出血腦屏障及腦-腦脊液屏障方面有重要的作用。在病理情況下血腦屏障破壞常伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP4的表達(dá)增高[7-8]。AQP4可以使腦組織在腦缺血低氧、感染、創(chuàng)傷、腫瘤、蛛網(wǎng)膜下腔出血等情況下產(chǎn)生病理性的水腫。關(guān)于AQP4與血腦屏障損害的關(guān)系觀點(diǎn)不一，有人發(fā)現(xiàn)AQP4在缺血低氧等病理情況下表達(dá)增高，并加重了細(xì)胞源性腦水腫從而使星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)血腦屏障的調(diào)控作用減弱，血腦屏障發(fā)生破壞；也有人發(fā)現(xiàn)在缺血低氧模型中腦組織AQP4蛋白表達(dá)降低[10-11]，使水的清除減少，從而加重水腫。Nicchia等[12]的實(shí)驗(yàn)顯示血腦屏障破壞同時(shí)AQP4表達(dá)增高，阻止血腦屏障破壞后AQP4表達(dá)減少，提示血腦屏障的破壞誘導(dǎo)了AQP4的表達(dá)；Ke等[13]認(rèn)為是AQP4的表達(dá)升高引起了血腦屏障的破壞。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，低O2高CO21d組小鼠腦組織AQP4mRNA與蛋白表達(dá)均明顯增高。AQP4的高表達(dá)促使水分進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，引起細(xì)胞水腫，說明AQP4影響血腦屏障的功能、星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)水的通透調(diào)控，但是究竟是AQP4的表達(dá)增高引起血腦屏障的破壞，還是血腦屏障的破壞誘導(dǎo)了AQP4的表達(dá)增高需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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