攪拌式生物反應(yīng)器換液培養(yǎng)臍血造血細(xì)胞的研究【摘要】為進(jìn)一步提高臍血造血細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)并達(dá)到臨床規(guī)模，本研究中利用自主開發(fā)的有溶氧和pH控制的攪拌式生物反應(yīng)器進(jìn)行了臍血造血細(xì)胞的換液培養(yǎng)。結(jié)果表明，培養(yǎng)中總細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、各系集落形成細(xì)胞(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，CFU-Mk)的擴(kuò)增倍數(shù)均高于方瓶培養(yǎng)，而且由于控制了較低的溶氧，所培養(yǎng)細(xì)胞中干/祖細(xì)胞含量顯著高于方瓶培養(yǎng)。該反應(yīng)器中培養(yǎng)的臍血造血細(xì)胞達(dá)到了臨床應(yīng)用的規(guī)模。結(jié)論：反應(yīng)器中培養(yǎng)環(huán)境更有利于干/祖細(xì)胞的維持和擴(kuò)增，而且可達(dá)到成人造血干細(xì)胞移植所需細(xì)胞量。

【關(guān)鍵詞】臍血

ExvivoCultureofUmbilicalCordBloodHematopoieticCellsinStirredTankBioreactorwithfeedingprotocol

AbstractToincreasetheexpansionmultipleofcordblood(CB)hematopoieticcellsandtoreachascaleforclinicalapplication，themononuclearcellsfromCBwereculturedinaautonomouslydevelopedstirredtankbioreactorwithdissolvedoxygen(DO)andpHcontrolling.Theresultshowedthattheexpansionmultipleoftotalcells，CD34+cells，andprogenitorscells(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，andCFU-Mk)inbioreactorweregreaterthanthatinT-flasks.TherateofprogenitorstototalcellsinbioreactorculturewasalsogreaterthanthatinT-flasks.Thegoodresultsinbioreactorshouldbeattributedtothecontrolled，optimizedDO.Clinical-scaleculturewasrealizedfromonesampleofCBinthisbioreactor.TheseresultssuggestedthatthecultureenvironmentinbioreactorwithoptimalDOandpHcontrollingismorefavorableforstem/progenitorcellmaintenanceandexpansion，andtheexpandedcellsfromonesampleofCBisenoughtotransplantforanadultpatient.

Keywordscordblood；hematopoieticcell；bioreactor；stirredculture

臍血細(xì)胞中富含造血干細(xì)胞，從而成為除骨髓和外周血之外一個(gè)重要造血干細(xì)胞來源，在臨床上有著廣泛應(yīng)用，但臍血中造血干細(xì)胞的絕對數(shù)量少，無法滿足成人的移植要求，而通過體外培養(yǎng)和擴(kuò)增有望克服這一矛盾。體外擴(kuò)增骨髓細(xì)胞、外周血細(xì)胞、臍血細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)都已有所報(bào)道［1，2］，證明了體外擴(kuò)增后細(xì)胞用于臨床的安全性和可行性。目前開發(fā)的體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)主要有平板灌注腔反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器等［3］。其中攪拌式生物反應(yīng)器能提供均一的培養(yǎng)環(huán)境，而且取樣和數(shù)據(jù)采集簡單，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，因此，在造血細(xì)胞臨床規(guī)模培養(yǎng)中有較好的應(yīng)用前景［3，4］。本研究應(yīng)用自主開發(fā)的攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，進(jìn)行臍血造血細(xì)胞的換液培養(yǎng)研究。

材料和方法

臍血(CB)和單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的分離

臍血由上海國際和平婦嬰保健院提供。供者要求是身體健康、發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。臍血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)密度梯度離心后，收集單個(gè)核細(xì)胞，并以IMDM培養(yǎng)液洗滌2次。

培養(yǎng)基和細(xì)胞因子

體外培養(yǎng)液用IMDM，使用時(shí)添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF、IL-3、IL-6、G-CSF和GM-CSF，其中SCF、IL-6購于北京寶賽生物技術(shù)公司，IL-3購于Pepro-Tech公司，G-CSF購于上海三維制藥廠，GM-CSF購于上海海濟(jì)生物技術(shù)有限公司。

造血細(xì)胞的反應(yīng)器換液培養(yǎng)

將分離得到的臍血單個(gè)核細(xì)胞以2×106cells/ml的密度在T-175方瓶中培養(yǎng)4天后，再接種到反應(yīng)器中或T-25型方瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行的2次實(shí)驗(yàn)中接種密度均為×106cells/ml。反應(yīng)器為自主開發(fā)產(chǎn)品，其中反應(yīng)器中所用材料經(jīng)過造血細(xì)胞的生物相容性檢驗(yàn)，反應(yīng)器工作體積為300-500ml，攪拌系統(tǒng)為磁力攪拌，轉(zhuǎn)速控制為30r/min。反應(yīng)器的溫度控制為37℃，溶氧和pH通過調(diào)節(jié)空氣、氮?dú)?、氧氣和二氧化碳的流量來控制，通氣方式為表面通氣。pH控制在，溶氧控制為飽和溶解空氣的25％。細(xì)胞接種到反應(yīng)器后，待細(xì)胞密度生長至×106cells/ml后進(jìn)行換液，即取出50％的細(xì)胞液，并加入相同體積含有相同細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)中以T-25方瓶作對照，每瓶裝液7ml，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，方瓶與反應(yīng)器中換液比例和頻率相同。

細(xì)胞計(jì)數(shù)及活性分析

臺(tái)盼藍(lán)染色后利用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行活細(xì)胞和總細(xì)胞的計(jì)數(shù)，由于實(shí)驗(yàn)中很少能見到被染成藍(lán)色的細(xì)胞，因此，未進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞活性。

造血細(xì)胞的集落檢測

集落的檢測體系為IMDM培養(yǎng)液，添加20％胎牛血清，4mmol/ml谷氨酰胺，含％甲基纖維素(4000cp，Sigma)，以及人重組造血生長因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、EPO，其濃度分別為50、20、20、20、20ng/ml和2U/ml，并添加1％牛血清白蛋白。取(1-3)×104培養(yǎng)或沒培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞加入ml集落培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天后，進(jìn)行CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix計(jì)數(shù)，其中CFU-Mix為至少含有粒細(xì)胞和紅細(xì)胞的集落。

CFU-Mk的檢測采用血漿塊法，細(xì)胞以1×105cells/ml的接種密度接種于24孔板中，每孔加50μl臍血漿，50μlg/L的CaCl2溶液，另加入含有TPO、IL-3、IL-6的α培養(yǎng)基，混勻后靜置凝固。培養(yǎng)10-12天后，用1∶3的甲醇/丙酮溶液原位脫水，并固定30分鐘，然后按次序加入1%BSA、鼠抗人CD41抗體、生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、抗生物素蛋白-堿性磷酸酯酶復(fù)合物，染色后在40×目鏡下觀測呈紅色的集落。

細(xì)胞表型分析

流式細(xì)胞儀分析中所用抗體為PharMingen公司產(chǎn)品。取×106未擴(kuò)增或擴(kuò)增后的細(xì)胞加入ml離心管中，用PBS洗2遍，離心后倒掉上清液，加PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD34單克隆抗體和FITC偶聯(lián)的小鼠抗人CD45單克隆抗體各10μl，4℃孵育30分鐘。PBS洗2遍，離心后，每管加1mlFACS保存液；標(biāo)記抗體后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果用LysisII軟件處理。

結(jié)果

總細(xì)胞的擴(kuò)增

由圖1可見，換液培養(yǎng)時(shí)，總細(xì)胞在18天的培養(yǎng)中一直維持?jǐn)U增，在開始的14天中反應(yīng)器和方瓶中總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)相差不大，14天后開始有所差別，說明培養(yǎng)到后期方瓶中細(xì)胞增殖潛力不如反應(yīng)器。擴(kuò)增到18天時(shí)，兩批實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中總細(xì)胞分別擴(kuò)增倍和倍，方瓶低于反應(yīng)器中擴(kuò)增倍數(shù)。

干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增

CFU-Mix由于具有多向分化潛能，代表了較原始的干/祖細(xì)胞，換液培養(yǎng)中CFU-Mix擴(kuò)增情況如圖2所示，兩次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中CFU-Mix的擴(kuò)增分別在第10天和第9天達(dá)到最大，擴(kuò)增倍數(shù)分別為和，方瓶中第7-8天達(dá)到最大，而后逐漸下降，其擴(kuò)增倍數(shù)明顯低于反應(yīng)器中。反應(yīng)器中培養(yǎng)至14天仍可檢測到CFU-Mix，而方瓶中10天后僅能檢測到很少的CFU-Mix。

CFU-GM的擴(kuò)增在14天左右達(dá)到最大，而后維持?jǐn)?shù)天，或有所下降，而方瓶中擴(kuò)增倍數(shù)在第10天達(dá)到最大，而后開始較快下降，而反應(yīng)器中CFU-GM擴(kuò)增倍數(shù)一直高于方瓶，最大擴(kuò)增倍數(shù)分別為和，顯著高于方瓶。

BFU-E達(dá)到最大擴(kuò)增倍數(shù)的時(shí)間較早，在7天左右，由于本實(shí)驗(yàn)中沒有添加EPO，所以BFU-E的擴(kuò)增倍數(shù)不高，由圖2可以看出，反應(yīng)器中擴(kuò)增倍數(shù)一直高于方瓶。

反應(yīng)器中CFU-Mk的擴(kuò)增倍數(shù)在10天時(shí)達(dá)到最大，而后逐漸下降，14天后基本檢測不到CFU-Mk，而方瓶中第7-9天達(dá)到最大后就開始較快地下降。擴(kuò)增最大時(shí)，兩次實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器中分別擴(kuò)增倍和倍。

培養(yǎng)中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增如圖3所示，反應(yīng)器擴(kuò)增倍數(shù)一直上升，至14天時(shí)達(dá)到最大，方瓶培養(yǎng)到第7天時(shí)與反應(yīng)器相差不大，第10天開始有較大差異，第14天的擴(kuò)增倍數(shù)比第10天時(shí)提高不大。由圖看見最終反應(yīng)器中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)高于方瓶培養(yǎng)。

反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模

附表顯示了2次實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)器培養(yǎng)的規(guī)模，由附表可見，如果不取出細(xì)胞而采用流加方式培養(yǎng)細(xì)胞，則培養(yǎng)到12天時(shí)，第1次實(shí)驗(yàn)中可得到×109總細(xì)胞、×106CFU-Mix、×106CFU-GM和×106CD34+細(xì)胞，第2次實(shí)驗(yàn)可得到×109總細(xì)胞、×106CFU-Mix、×106CFU-GM、和×106CD34+細(xì)胞。

造血干細(xì)胞移植中細(xì)胞需要達(dá)到的理想量是總細(xì)胞×107cells/kg，和CFU-GM×105cells/kg，CD34+細(xì)胞×106cells/kg。按此計(jì)算，對于1個(gè)50公斤體重的病人總細(xì)胞、CFU-GM、CD34+細(xì)胞必須分別達(dá)到×109、10×106、和125×106個(gè)。我們的檢測中是作同一集落分析而分別計(jì)數(shù)CFU-GM和CFU-Mix，而CFU-Mix是比CFU-GM更原始的細(xì)胞，因此，這兩個(gè)數(shù)字應(yīng)該相加再與文獻(xiàn)中所述的CFU-GM量相比才是科學(xué)的，從總細(xì)胞和集落形成細(xì)胞數(shù)來說，反應(yīng)器培養(yǎng)所得細(xì)胞可達(dá)到理想量的要求。CD34+細(xì)胞數(shù)雖然小于理想量，但也可滿足最低量25×106細(xì)胞的要求。因此，如果利用該反應(yīng)器一直補(bǔ)料培養(yǎng)，可以從一份臍血培養(yǎng)得到足夠用于臨床的細(xì)胞量。

討論

造血干/祖細(xì)胞移植目前在臨床中主要用于造血干/祖細(xì)胞缺陷性血液病、先天性免疫病、各類自身免疫病、及實(shí)體瘤的治療，是一種重要的細(xì)胞治療手段。臍血造血干/祖細(xì)胞作為一種造血干/祖細(xì)胞來源，

由于數(shù)量較少，在臨床上只能用于兒童患者，要應(yīng)用于成人患者則必須通過體外擴(kuò)增增加其數(shù)量，其中培養(yǎng)環(huán)境中的溶氧、pH、細(xì)胞因子、培養(yǎng)方式等對擴(kuò)增效果有重要影響。因此，要實(shí)現(xiàn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)在臨床上應(yīng)用，需要開發(fā)出足夠大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)系統(tǒng)以及相應(yīng)的擴(kuò)增工藝。本研究采用攪拌式生物反應(yīng)器在臨床規(guī)模擴(kuò)增了臍血單個(gè)核細(xì)胞，擴(kuò)增得到的細(xì)胞中代表造血干/祖細(xì)胞的CD34+細(xì)胞、CFU-GM、CFU-Mk等細(xì)胞的含量均較常規(guī)的靜態(tài)培養(yǎng)高，更適于臨床應(yīng)用。而且，其培養(yǎng)規(guī)模達(dá)到了臨床應(yīng)用中所需移植細(xì)胞量的要求。

溶氧是造血細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，很多報(bào)道都表明，低氧分壓比正常氧分壓有利于造血干/祖細(xì)胞的維持和擴(kuò)增［6］，因此，我們在生物反應(yīng)器中控制的溶氧為飽和空氣的25%，這與5％氧分壓相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)器培養(yǎng)中不但細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)高，所得細(xì)胞中CFU-GM、CFU-Mix、CFU-Mk，CD34+細(xì)胞的含量都高于方瓶培養(yǎng)的結(jié)果，而且維持時(shí)間比方瓶中長，這應(yīng)該與反應(yīng)器中所維持的低溶氧有關(guān)。

值得注意的是，在本系統(tǒng)中雖然在一定程度上可以減緩造血干/祖細(xì)胞的分化速度，但并不能從根本上解決培養(yǎng)過程中造血干/祖細(xì)胞的分化問題。另外，本實(shí)驗(yàn)中所檢測的各類集落形成細(xì)胞及CD34+細(xì)胞都僅能代表造血祖細(xì)胞，因此其擴(kuò)增情況只能代表祖細(xì)胞的擴(kuò)增，如果要確定造血干細(xì)胞是否真正實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增，則需要進(jìn)行SCID小鼠體內(nèi)造血重建實(shí)驗(yàn)才能夠確定。

Collins等［3］也用400ml的有pH和溶氧控制的反應(yīng)器進(jìn)行了臍血造血細(xì)胞的培養(yǎng)，其2次實(shí)驗(yàn)中總細(xì)胞分別擴(kuò)增了約35倍和200倍，而CFU-GM分別擴(kuò)增了約23倍和30倍，我們的結(jié)果與之相比相差不大。Kim等［7］在不控制pH和溶氧的轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行了骨髓造血細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)中只添加細(xì)胞因子組合IL-3、SCF、GM-CSF和EPO，結(jié)果總細(xì)胞和CFU-GM只擴(kuò)增了8倍和5倍。在此基礎(chǔ)上添加基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著提高了總細(xì)胞的擴(kuò)增，CFU-GM擴(kuò)增也提高到了17倍，CFU-GM含量大大增加。我們的實(shí)驗(yàn)中所添加的細(xì)胞因子為IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF和G-CSF，其中促分化的IL-3、GM-CSF和G-CSF添加量都較小，分別為5ng/ml、2ng/ml、2ng/ml，這對防止細(xì)胞過早分化有一定作用。如果在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，如添加基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基或FL和TPO等能促進(jìn)干細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子等，有望進(jìn)一步提高造血干/祖細(xì)胞的增殖。

除造血干/祖細(xì)胞外，為縮短粒細(xì)胞和血小板的恢復(fù)期，以及為放療和化療提供輔助治療，臨床中對粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞的需求也很大，因此，培養(yǎng)成熟細(xì)胞也是造血細(xì)胞體外擴(kuò)增的重要內(nèi)容之一。Neildez-Nguyen等［8］在體外培養(yǎng)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中所培養(yǎng)的總細(xì)胞數(shù)達(dá)1010個(gè)，這些前體細(xì)胞在輸入小鼠體內(nèi)后可分化為成熟的紅細(xì)胞，對于如此大規(guī)模的成熟細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器將更有優(yōu)勢。

【參考文獻(xiàn)】

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3CabralJMS.Exvivoexpansionofhematopoieticstemcellsinbioreactors(review).BiotechnologyLetters，2001；23:741-751

4CollinsPC，MillerWM，PapoutsakisET.Stirredcultureofperipheralandcordbloodheatopoieticcellsoffersadvantagesovertraditionalstaticsystemsforclinicallyrelevantapplica