7.自噬雙標腺病毒〔mRFP-GFP-LC3使用指南源還有爭議,大部分表現(xiàn)為雙層膜,有時多層或單層包裹部分胞質(zhì)和細內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體,最后與溶酶體融合形成westernblot檢測LC3的剪切；通過電鏡觀測自噬體的形成；在熒光近幾年對自噬流的研究日趨增多,針對于此我們漢恒生物科技〔上海了用于實時監(jiān)測自噬<流>的mRFP-GFP-LC3腺病毒,mRFP用于標記及追蹤LC3,GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體,即由于GFP熒光蛋白對酸性敏感,當自噬體與溶酶體融合后GFP熒光發(fā)生淬滅,此時只能檢測到紅色熒光。這種串聯(lián)的熒光蛋白表達載體系統(tǒng)直觀清晰的指示了細胞自噬流的水平,是我們自噬研究mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作2/7.冰箱保完。在-20℃下長期保存。如果病毒儲存時間超過6實驗需求自行分裝或購買經(jīng)過分裝的養(yǎng)目的細胞S物實驗建議使用注射用平衡液來稀釋,并盡激處理的時間來選擇感染腺病毒的時間,短時程處理〔一周之內(nèi)建議先感染腺病毒之后再進行處理,長時程刺激的建議在刺激結(jié)束前I染正式感染目的細胞前,需要做一個預實驗以確定目的細胞中加入的3/7.,接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不同,一般是保證第二天件允許最好使用共聚焦顯微鏡拍照,此時需要把細部分細胞鐵壁能力不是很強,此時需要預先在玻見下表格。加入的病毒量范圍在MOI=20~50內(nèi)〔具體感染的操作量0.3cm224-well12-well6-well60mm100mm100ul500ul1ml2ml4ml10ml50ul250ul500ul1ml2ml5ml2cm24cm210cm220cm260cm296-well/cm2是懸浮或半懸浮細胞,/7.,進行低速離心,去掉大部分上清,然后加入適量的病感染24小時后,可以開始觀察到GFP以及RFP表達,36-48小時可5/7.即只是自噬體.紅色的斑點指示自噬溶酶體,通過不同顏色斑點的計數(shù)可以清晰的看出自噬流的強弱:一般統(tǒng)計采用人為計數(shù)的方法,也AntioxidRedoxSignal14<11>:2179-2190.-092-0065；xduringischemia/reperfusion."AntioxidRedoxSignal14<11>:2179-2190.Ma,X.,etal.<2012>."Impairedautophagosomeclearancecontributesto3170-3181..anddisease."NEnglJMed368<7>:651-662.M.Lee,T.Strowig,F.Arrey,G.Conenello,M.Pypaert,J.Andersen,A.blocksautophagosomefusionwithlysosomes."CellHostMicrobe6<4>:367-380.<2010>."DeacetylationofFoxObySirt1PlaysanEssentialRoleinMediatingStarvation-InducedAutophagyinCardiacMyocytes."CircRes107<12>:1470-1482.Levine,B.andG.Kroemer<2008>."Autophagyinthepathogenesisofdisease."Cell132<1>:27-42.Mizushima,N.,T.YoshimoriandB.Levine<2010>."Methodsinmammalianautophagyresearch."Cell140<3>:313-326."Plasmamembranecontributestotheformationofpre-autophagosomalstructures."NatCellBiol12<8>:747-757.Ravikumar,B.,S.Sarkar,J.E.Davies,M.Futter,M.Garcia-Arencibia,S.Luo,D.C.Massey,F.M.Menzies,K.Moreau,U.Narayanan,M.Renna,"Regulationofmammalianautophagyinphysiologyandpathophysiology."PhysiolRev90<4>:1383-1435.Wei,Y.,Z.Zou,N.Becker,M.Anderson,R.Sumpter,G.Xiao,L.Kinch,Minna,G.BhagatandB.Levine<2013>."EGFR-MediatedBeclin1PhosphorylationinAutophagySuppression,TumorProgression,andTumorChemoresistance."Cell154<6>:1269-1284.加入病毒數(shù)量/ul0.5；2；6.5；7.5；25；15；50大約數(shù)目2-5×1041-2×1052-3×1055×1051-2×1061-5×1060.5-2×1071-3×1072.5-5×1070.5-2×10850-10050-10050-10050-10050-10096well48well24well12well6well0.5-2ul1-3ul2.5-5ul5-20ulMOI值腺病毒規(guī)格/7.3535mmdish1-2×10650-1000.5-2×1085-20ul5；15；5060mmdish2-4×10650-1001-4×10810-40ul10；30；100100mmdish6-10×10650-1003-10×10830-80ul30；100；300150mmdish1-2×10750-1000.5-2×10950-200ul60；180；600腺病毒滴度以1010/ml為準,其他滴度需相應換算；大約細胞數(shù)目是根據(jù)80%~100%細胞密度估算而出,具體細胞數(shù)請種細胞時進行細胞計數(shù)。