用16SrDNA方法鑒定細(xì)菌種屬一、 實驗?zāi)康恼莆?6SrDNA對細(xì)菌進行分類的原理及方法；掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等實驗操作。二、 實驗原理細(xì)菌rRNA（核糖體RNA）按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。16SrDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16SrDNA序列測序的方法對細(xì)菌進行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16SrDNA特異引物PCR擴增、擴增產(chǎn)物純化、DNA測序、序列比對等步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。16SrDNA是細(xì)菌的系統(tǒng)分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其種類少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80%）,分子大小適中，存在于所有的生物中，其進化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。在大多數(shù)原核生物中rDNA都具有多個拷貝，5S、16S、23SrDNA的拷貝數(shù)相同。16SrDNA由于大小適中，約1.5Kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家接受。16SrRNA的編碼基因是16SrDNA，但是要直接將16SrRNA提取出來很困難，因為易被廣泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鑒定細(xì)菌，其技術(shù)路線如下：細(xì)菌基因組的提?。壕w破碎卜|得到胞內(nèi)可溶I一分離出DNA|~|純化DNA|PCR的基本原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。二、操作步驟1、細(xì)菌基因組DNA提取；2、 PCR擴增；3、 細(xì)菌基因組DNA及PCR產(chǎn)物的電泳檢測；4、 擴增片段回收；5、 DNA片段測序。三、結(jié)果處理與分析在回收擴增片段時，紫外燈下條帶呈現(xiàn)綠色熒光，將凝膠中綠色熒光部分切割分離出來，放入已稱重的2ml離心管中，空的離心管為1.02g，放入回收的凝膠后為1.42g，，則凝膠為400mg，因此加入的BindingBuffer為1200u1。我們小組選用B116Ssequence，以下為制作進化樹過程：1、根據(jù)B116S基因序列，到NCBI上比對，確定其種屬NCBI主頁()依次點擊進入BLAST選擇nucleotideBLAST將B1序列復(fù)制到文本，框里ChooseSearchSet處點復(fù)選按鈕others，最后點BLAST點擊BLAST后，數(shù)據(jù)進行提交。BLAST結(jié)果如下：圖中“Evalue”指標(biāo)與其他指標(biāo)不同，它的數(shù)值越小相似程度越高，其他幾個(如Totlescore)都是數(shù)值越高相似度越高。我組將數(shù)據(jù)按照Querycover從100%開始從大到小排列，從不同相似度一共選出14組數(shù)據(jù)。導(dǎo)出數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)導(dǎo)出格式選擇FASTA：選擇大腸桿菌作為外屬，導(dǎo)出大腸桿菌下載MEG并安裝，我組使用的是MEGA5.02，并將B1序列導(dǎo)入MEG通過Edit中的Copy及Paste將B1序列和大腸桿菌序列導(dǎo)入我們選中的14個序列中選擇W中AlignDNA，然后點擊OK

（10） 選擇Date中的MEGAFormat，生成meg文件（11） 打開.meg文件（12） 生成進化樹（13） 導(dǎo)出文件，我組導(dǎo)出PDF格式2、進化樹B1應(yīng)該屬于Proteus（變形桿菌屬）電泳圖譜：I從右數(shù)第四個條帶為本組電泳條帶，條帶清晰且明亮，無明顯拖尾四交流與討論細(xì)菌中包括有三種核糖體RNA，分別為5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。16SrRNA對應(yīng)于基因組DNA上的一段基因序列稱為16SrDNA。5SrRNA雖易分析，但核苷酸太少，沒有足夠的遺傳信息用于分類研究；23SrRNA含有的核苷酸數(shù)幾乎是16SrRNA的兩倍，分析較困難。而16SrRNA相對分子量適中，又具有保守性和存在的普遍性等特點，序列變化與進化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，因此我們選擇16SrRNA進行提純測序用試劑盒提取RNA，一定要注意盒內(nèi)藥品名稱，不要弄錯提取DNA過程中，加入GA緩沖液后，一定要小心吹打混勻，但要注意不要產(chǎn)生氣泡。制作PCR擴增產(chǎn)物的過程中，第一步要先加水，因為DNA液和其他藥品太少，不事先加水，會是使其他樣液加到離心管壁上或根本加不進來，造成樣液損失。我組的DNA電泳雖然亮度略低，但是PCR產(chǎn)物條帶清晰明亮，同時并無拖尾現(xiàn)象，說明我組DNA擴增之后含量很高，而且質(zhì)量也很好PCR反應(yīng)五要素：引物（PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+作為聚合激活劑）。通過這次實驗我學(xué)到了鑒定細(xì)菌種屬的一種方法，16SrDNA法，雖然按照試劑盒進行實驗操作非常簡單，但這次實驗的目的并不在于完成一次實驗得到實驗結(jié)果，而在于通過這一次實驗學(xué)會舉一反三，切實地應(yīng)用到以后的科研實驗中去。關(guān)于試劑盒的使用，我們不僅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代稱命名的一些試劑的用途以及可能成分，這非常有利于以后的科研工作。同時，操作過程中嚴(yán)格按照步驟進行，注意試劑的使用不要出錯。電泳圖譜中第一塊膠是提完DNA之后、進行PCR之前的樣品所跑的電泳條帶，能看出條帶的表明提取到了DN