樺褐孔菌石油醚提取物的抗腫瘤作用研究【摘要】目的探討樺褐孔菌石油醚提取物抗腫瘤作用。方法體外實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定了IOPE對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的抑制率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將接種S180腫瘤細(xì)胞后的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，給予IOPE10d，停藥后24h處死動(dòng)物，稱(chēng)體重，摘出腫瘤，測(cè)定腫瘤抑制率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞活性。結(jié)果在體外，IOPE對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞具有毒性作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明中大劑量IOPE對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用，可增加脾指數(shù)及胸腺指數(shù)，對(duì)體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能和NK細(xì)胞活性亦有增強(qiáng)作用。結(jié)論樺褐孔菌石油醚提取物具有明顯的抗腫瘤活性。

【關(guān)鍵詞】樺褐孔菌石油醚提取物抗腫瘤

TheExperimentalStudyonAntitumorEffectofPetroleumEtherExtractsofIonontusObliquus

Abstract：ObjectiveTostudytheantitumoreffectofpetroleumetherextractsofInonotusObliquus(IOPE).MethodsInvitrotest,thetumorinhibitoryeffectstoHelacellswerestudiedbyMTTmethod.Invivo,themicewereinoculatedwithS180tumorcellsanddividedinto5groupsrandomly(n=10),whichwereadministeredIOPE10dcontinuously.Themicewerekilledandweighed24hafterthelastadministration,andtheinhibitionratioofthetumorweightinthespleenindex,thymusindex,transformationfunctionoflymphocyteandNKcellactivitieswerecalculated.ResultsThevitrotestshowedIOPEhadsignificantacutetoxicitytotheHelatoumorcells.TheIOPEcouldincreasethelevelsofinhibitionratiooftumorweightandthespleenindexandthymusindexinmiceandincreasethetransformationfunctionoflymphocyteandNKcellactivitiesinIOPEhasobviousantitumoreffect.

Keywords：PetroleumetherExtractsofInonotusobliquus(IOPE)；Antitumor

樺褐孔菌Inonotusobliquus是一種大型真菌，主要分布于北緯45～50°的地區(qū)，如俄羅斯西西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū)、中國(guó)黑龍江、吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)等。作為一種民間草藥，樺褐孔菌在俄羅斯等國(guó)家已有很長(zhǎng)的使用歷史。近年的研究也表明，它在抗腫瘤、抗HIV、治療糖尿病等方面都具有一定的潛力［1～5］。成分研究表明，樺褐孔菌低極性提取物中含有大量的三萜類(lèi)化合物，主要為羊毛甾醇、樺褐孔菌醇及其衍生物。本文通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)樺褐孔菌中石油醚提取物抗腫瘤方面的作用及機(jī)理進(jìn)行了研究。

1材料與方法

藥品的制備樺褐孔菌子實(shí)體購(gòu)自大連王力靈芝行，由江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭維發(fā)教授鑒定，樣品保存于江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

將樺褐孔菌子實(shí)體稱(chēng)重、粉碎后用石油醚加熱萃取多次，過(guò)濾。濾液經(jīng)濃縮干燥后得到樺褐孔菌石油醚提取物，記為IOPE。

動(dòng)物與試劑

動(dòng)物及瘤株

昆明種ICR小鼠，體重為g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：蘇動(dòng)200402。自由攝食飲水，室溫℃。

S180肉瘤細(xì)胞、Hela人宮頸癌細(xì)胞、K293人胚腎細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所提供。

試劑MTT，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMSO，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)040221；生理鹽水，徐州遠(yuǎn)恒藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)04121311；RPMI1640培養(yǎng)基、RPMI1640完全培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；PBS溶液實(shí)驗(yàn)室自制。

方法

IOPE對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)［6］

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞及K293細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，150μl/孔，然后加入50μl不同濃度的IOPE，總體積200μl/孔，藥品的終濃度為0，50，100，200，300，500g/ml，每組均設(shè)6個(gè)樣本孔。在37℃，5%CO2、飽濕條件下培養(yǎng)72h，以MTT比色法測(cè)吸光度并計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率和對(duì)K293細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)率。

IOPE對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)［7］

取傳代后7d的S180肉瘤細(xì)胞懸液，每鼠右后腋窩皮下接種ml。次日隨機(jī)分組，每組10只，于接種后24h給藥。分別為IOPE高劑量組(240mg/kg)，中劑量組(120mg/kg)，低劑量組(60mg/kg)，環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組(20mg/kg)，生理鹽水對(duì)照組以及正常對(duì)照組，均以ml/10g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10d。末次給藥后24h，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，分離、摘取脾臟和胸腺，計(jì)算抑瘤率，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［8］

荷瘤小鼠按條件給藥10d，于停藥24h后將小鼠放血致死，取脾，按文獻(xiàn)制備脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞濃度調(diào)整為4×106/ml，向96孔板加入脾細(xì)胞懸液100μl/孔，然后加入1μg/ml的ConA100μl/孔，對(duì)照孔加RPMI1640液，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37℃，飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72h，以MTT法測(cè)OD值，以O(shè)D值大小反映淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

IOPE促進(jìn)NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)［9］

同處理動(dòng)物和制備脾細(xì)胞，取不同藥物濃度處理的脾細(xì)胞作效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，另取Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞=50:1，每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照組和效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h，并以MTT法于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值，并計(jì)算NK細(xì)胞活性。

數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進(jìn)行處理，以t-檢驗(yàn)計(jì)算組間的差異。

2結(jié)果

IOPE對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1樺褐孔菌石油醚提取物對(duì)Hela細(xì)胞和K293細(xì)胞的增殖抑制

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，IOPE各劑量組對(duì)腫瘤的抑制率均大，且基本呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，細(xì)胞毒作用明顯。同時(shí)多個(gè)劑量組IOPE對(duì)K293的生長(zhǎng)都呈現(xiàn)較高的生長(zhǎng)促進(jìn)率，說(shuō)明了IOPE對(duì)正常細(xì)胞的增殖無(wú)抑制作用。

IOPE對(duì)小鼠S180肉瘤抑制率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。表2樺褐孔菌石油醚提取物對(duì)小鼠S180肉瘤的腫瘤抑制率的影響

結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比較，IOPE的中大劑量組對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤均具一定程度的抑制作用。結(jié)果還表明，IOPE具有明顯增加荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用，呈劑量依賴(lài)關(guān)系，且與陽(yáng)性對(duì)照組間存在顯著性差異。

淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3樺褐孔菌石油醚提取物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用

結(jié)果表明在ConA的誘導(dǎo)下荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖普遍低于正常小鼠，而中大劑量IOPE能有效提高實(shí)驗(yàn)OD值，且與陽(yáng)性對(duì)照組存在顯著性差異，這表明IOPE能有效地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，能夠提高荷瘤小鼠的免疫水平。

IOPE促進(jìn)NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)果顯示IOPE能有效促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，而且中大劑量組明顯高于環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組的NK細(xì)胞活性。

3討論

從天然產(chǎn)物特別是大型真菌中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)是抗腫瘤新藥物研發(fā)的一個(gè)重要方向。一般認(rèn)為大型真菌是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力，從而起到抗腫瘤的療效的，但研究的重點(diǎn)多集中在真菌的水提物組分上。

本研究通過(guò)體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)和免疫藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)樺褐孔菌多糖的抗腫瘤作用及機(jī)制進(jìn)行了研究。體外對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)給藥濃度為50g/ml時(shí)，IOPE就具有直接殺死腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系；同時(shí)實(shí)驗(yàn)還表明，IOPE對(duì)正常細(xì)胞的增殖無(wú)抑制作用，大濃度時(shí)甚至能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，120mg/kg以上劑量的IOPE灌胃給藥時(shí)，對(duì)小鼠S180肉瘤均有一定的抑制作用。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，其中由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起著更重要的作用，T細(xì)胞的激活是發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)的重要條件。NK細(xì)胞缺乏免疫記憶和MHC約束性，能溶解廣譜的腫瘤細(xì)胞、包括同基因的、同種異基因的，以及異種的靶細(xì)胞，是一類(lèi)在早期腫瘤免疫機(jī)制中起重要作用的效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)機(jī)體抗腫瘤起著重要作用。本研究在證實(shí)IOPE具有良好抗腫瘤效果的基礎(chǔ)上，探討了IOPE對(duì)小鼠S180肉瘤的免疫調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)理。實(shí)驗(yàn)表明IOPE對(duì)兩個(gè)主要免疫學(xué)器官脾臟和胸腺均有增重作用，并呈劑量依賴(lài)性。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中大劑量組IOPE可促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)，各劑量組IOPE對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性均有明顯促進(jìn)作用。以上結(jié)果顯示，IOPE的抗腫瘤作用可能是通過(guò)其細(xì)胞毒作用及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力，刺激T細(xì)胞、NK細(xì)胞等功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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