病毒的細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)容01實(shí)驗(yàn)器材02細(xì)胞準(zhǔn)備03病毒接種04病毒培養(yǎng)05注意事項(xiàng)

一、實(shí)驗(yàn)器材（以新城疫病毒的細(xì)胞培養(yǎng)為例）試劑

雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、新城疫病毒（雞胚尿囊液）、細(xì)胞生長(zhǎng)液（DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液+10%胎牛血清）、細(xì)胞維持液（DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液+2%胎牛血清）、無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液等。儀器和耗材

細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25cm2）、離心管、超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、微量移液器、吸頭等。

二、細(xì)胞準(zhǔn)備一般需要在接種病毒前24h，進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇。為了能讓細(xì)胞在第二天內(nèi)達(dá)到90%的匯合率，每瓶接種的細(xì)胞密度不能太小。一般建議1傳2。關(guān)于細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)詳見相關(guān)章節(jié)課件和視頻。接種前90%細(xì)胞匯合

三、病毒接種觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

接種后的第二天，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)情況的觀察。若細(xì)胞生長(zhǎng)能夠達(dá)到90%匯合程度，就可以進(jìn)行病毒的接種。細(xì)胞處理

接入病毒前，用微量移液器先移棄培養(yǎng)瓶中的生長(zhǎng)液，向培養(yǎng)瓶中加入2ml無血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，并緩慢搖晃洗細(xì)胞面1次，以去掉殘留的生長(zhǎng)液。用移液管吸棄培養(yǎng)瓶中殘留的無血清的DMEM。

接種病毒標(biāo)記信息

試驗(yàn)中，我們應(yīng)設(shè)置兩個(gè)組。一個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組。在這兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶身側(cè)面標(biāo)記好相關(guān)信息。接種病毒

用微量移液器將1ml的病毒液加入試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋上瓶蓋，緩慢搖晃培養(yǎng)瓶，讓病毒液在細(xì)胞面上來回10幾次。同時(shí)，在對(duì)照組細(xì)胞中，加入相同體積的細(xì)胞維持液作對(duì)照；孵育

將試驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)瓶一起放入37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。其中每隔15min，需要將種毒瓶和對(duì)照瓶拿出，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，保證病毒液或維持液能在細(xì)胞面上來回20次左右，使病毒液或維持液能充分接觸細(xì)胞。

四、病毒培養(yǎng)病毒培養(yǎng)

孵育結(jié)束后，將兩組細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中移出，在無菌間超凈工作臺(tái)中用移液器將培養(yǎng)瓶中多余的病毒液吸棄，更換吸頭，向兩組培養(yǎng)瓶中各加入5ml細(xì)胞維持液，擰好瓶蓋，將加完細(xì)胞維持液的培養(yǎng)瓶都放回37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)結(jié)果觀察

培養(yǎng)24h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。如此，每天觀察細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變（CPE）的情況，并拍照，直到有90%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)后，可以進(jìn)行收毒。病毒接種后24小時(shí)病毒接種后48小時(shí)接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)未接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)

五、注意事項(xiàng)整個(gè)過程注意無菌操作使用的病毒液須是無菌處理過的接種后病毒孵育