大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第一課時(shí)第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2、特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物.3、種類病毒原核生物：細(xì)菌、放線菌真菌：酵母菌原生動(dòng)物

一、微生物及特點(diǎn)1、微生物：一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五二、關(guān)于細(xì)菌1、基本結(jié)構(gòu)2、分裂方式3、生殖類型4、變異類型5、在基因工程中的應(yīng)用第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、細(xì)菌的外形大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2、細(xì)菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)型:異養(yǎng)型:

光能自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌寄生菌：腐生菌：第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3、細(xì)菌的革蘭氏染色

革蘭氏染色法是一種用于細(xì)菌的染色法。此法將細(xì)菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，提供微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)。2、培養(yǎng)基的成分三、細(xì)菌的培養(yǎng)碳源、氮源、生長因子、無機(jī)鹽、水細(xì)菌喜葷，霉菌喜素細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取液、氯化鈉酸堿度：中性偏堿霉菌培養(yǎng)基：無機(jī)物或者添加蔗糖的麥芽汁酸堿度：中性偏酸第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3、培養(yǎng)基的類型a.按照培養(yǎng)基的形態(tài)固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：分離細(xì)菌，保留菌種等培養(yǎng)細(xì)菌第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五固體培養(yǎng)基：菌落單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五b.按培養(yǎng)基成分合成培養(yǎng)基：成分明確天然培養(yǎng)基：成分不明確c.按培養(yǎng)基功能1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：含有一般細(xì)菌生長的基本營養(yǎng)物質(zhì)。2、營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分上添加某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如血清或者生長因子，用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高的微生物。50mL液體LB培養(yǎng)基：蛋白胨0.5,酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，水50mL(固體培養(yǎng)基再加1g瓊脂)第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3、選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。4、鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或者化學(xué)藥品，用于鑒別不同種類的微生物。如：尿素固體培養(yǎng)基可以分離以尿素為氮源的微生物如：伊紅和美藍(lán)與大腸桿菌代謝產(chǎn)物結(jié)合可以使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，可以用來鑒別大腸桿菌。第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五四：無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五（１）消毒定義：2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

（2）滅菌的定義：消滅病原微生物的過程。是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽胞、孢子），達(dá)到完全無菌的過程。第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3、常用消毒方法1、對接種室、接種箱或者超凈工作臺可用紫外線進(jìn)行物理消毒,然后用酒精進(jìn)一步消毒2、實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、灼燒滅菌滅菌的方法：4.常用的滅菌的方法第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2、高壓蒸汽滅菌：壓力：1kg/cm2溫度：121℃時(shí)間：15min.培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、移液管、槍頭、三角刮刀、接種環(huán)、無菌水、培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌不會破壞培養(yǎng)基的成分。第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1.無菌技術(shù)有什么好處？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手1、避免實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物被雜菌污染2、避免操作者自身被微生物感染。（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思考：第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五四、細(xì)菌的分離分離方法:劃線分離法、涂布分離法劃線分離法：方法簡單涂布分離法：單菌落更容易分開，但操作復(fù)雜分離目的：得到單菌落是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五平板劃線的操作第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1.旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；2.是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個(gè)條狀的菌落。第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1、上述操作過程中，接種環(huán)有哪些灼燒過程？思考：2、各次灼燒的目的分別是什么？3、劃線結(jié)束后，接種環(huán)還需要灼燒嗎？第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；操作中每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端。1、接種前灼燒2、操作過程中每次劃線前灼燒需要。殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。5.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單菌落。第二十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五五、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)操作1、培養(yǎng)基的配置與滅菌

取2個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌的劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五

2、倒平板

滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作臺上倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時(shí)右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3、大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)。注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4、劃線分離第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五5、大腸桿菌分離后保存1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?(1)膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學(xué)和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。第三十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五4.實(shí)驗(yàn)完成后,接種過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理?所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄第三十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期五5.如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?