第二代測序數(shù)據(jù)分析原理徐汪節(jié)當前第1頁\共有66頁\編于星期三\9點三代DNA測序技術之比較第一代測序技術：Sanger測序法第二代測序技術：454測序……

第三代測序技術：？直接測序法：？2023/5/292當前第2頁\共有66頁\編于星期三\9點第一代測序技術：

Sanger測序法

——簡便、快速2023/5/293當前第3頁\共有66頁\編于星期三\9點逐漸被遺忘的測序技術：

Maxam-Gilbert的DNA化學降解法

2023/5/294當前第4頁\共有66頁\編于星期三\9點Sanger測序的局限通過幾十年的改進，第1代測序儀的讀長可以超過1000bp，原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%，測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每天的數(shù)據(jù)通量可以達到60萬堿基。但是，不管怎么改進，第1代測序技術在速度和成本方面都已達到了極限（因為對電泳分離技術的依賴,使其難以進一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且難以通過微型化降低測序成本）。在此種情況下，第二代測序技術（Next-generationsequencing)應運而生。2023/5/295當前第5頁\共有66頁\編于星期三\9點概要主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇當前第6頁\共有66頁\編于星期三\9點第二代測序技術454測序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……2023/5/297當前第7頁\共有66頁\編于星期三\9點4542023/5/298當前第8頁\共有66頁\編于星期三\9點SOLID2023/5/299當前第9頁\共有66頁\編于星期三\9點Illumina2023/5/2910當前第10頁\共有66頁\編于星期三\9點其他PolonatorCompleteGenomics……2023/5/2911當前第11頁\共有66頁\編于星期三\9點2023/5/2912當前第12頁\共有66頁\編于星期三\9點第二代測序技術的共同點1將目標DNA剪切為小片段2單個小片段DNA分子結(jié)合到固相表面3單分子獨立擴增4每次只復制一個堿基（A,C,T,G）并檢測信號5高分辨率的成像系統(tǒng)。2023/5/2913當前第13頁\共有66頁\編于星期三\9點第二代測序技術的局限與第一代測序儀相比，以合成測序為基礎的下一代測序平臺速度顯著提高，成本明顯降低。每臺設備每天產(chǎn)出千兆堿基的序列不足為奇。但是,除了羅氏的454平臺之外，讀長短成了下一代測序平臺的致命傷，這主要是由于DNA簇中存在的光學信號移相造成的。而應運而生的單分子測序技術是解決這一問題的一種方法。2023/5/2914當前第14頁\共有66頁\編于星期三\9點第三代測序技術：單分子測序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……2023/5/2915當前第15頁\共有66頁\編于星期三\9點2023/5/2916當前第16頁\共有66頁\編于星期三\9點直接測序法在所有上述三代測序技術中，序列都是在熒光或者化學發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下，通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學信號而間接確定的。除了需要昂貴的光學監(jiān)測系統(tǒng)，還要記錄、存儲并分析大量的光學圖像，這都使儀器的復雜性和成本增加。依賴生物化學反應讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用，在目前測序成本中比例相當大。直接讀取序列信息，不使用化學試劑，對于進一步降低測序成本是非?？扇〉?。為了實現(xiàn)這樣的目標，目前就有很多人在研究納米物理技術。在全球，許多公司和組織，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在進行納米孔測序的開發(fā)，不同的只是采用的方法或策略。2023/5/2917當前第17頁\共有66頁\編于星期三\9點2023/5/2918當前第18頁\共有66頁\編于星期三\9點2023/5/2919當前第19頁\共有66頁\編于星期三\9點SecondgenerationsequenceRoche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seq

RNA-seq當前第20頁\共有66頁\編于星期三\9點ExperimentsDNA-seq:denovo,resequencingRNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitationMethyl-seq:methylatedDNA(epigenome)當前第21頁\共有66頁\編于星期三\9點主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇當前第22頁\共有66頁\編于星期三\9點SequencingGlossaryReads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled當前第23頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第24頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第25頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第26頁\共有66頁\編于星期三\9點 全基因組denove分析工具當前第27頁\共有66頁\編于星期三\9點分析所需工具BowtiesoftwareSAMtoolsTopHatsoftareCufflinkssoftwareCummeRbundsoftware當前第28頁\共有66頁\編于星期三\9點外顯子組分析工具當前第29頁\共有66頁\編于星期三\9點主要的測序平臺基因組分析原理轉(zhuǎn)錄組分析原理分析策略的選擇當前第30頁\共有66頁\編于星期三\9點常規(guī)分析TranscriptsquantificationSplicingsitesdiscoveryandquantificationGenediscoverySNP/INDELdetectionAllelespecificexpression當前第31頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第32頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第33頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第34頁\共有66頁\編于星期三\9點UniGene拼接目的：將預處理后reads進行拼接，得到拼接結(jié)果。

原理：應用deBruijngraphpath算法對reads進行denovo拼接；對上一步的拼接結(jié)果，再用HamiltonPath算法拼接。

結(jié)果：UniGene序列，UniGene統(tǒng)計信息，序列長度分布圖當前第35頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第36頁\共有66頁\編于星期三\9點3.數(shù)據(jù)庫注釋目的：對拼接得到的UniGene進行功能注釋

原理：通過blast+算法將拼接得到的UniGene序列與數(shù)據(jù)庫進行比對

結(jié)果：比對結(jié)果表格，物種分布統(tǒng)計和Evalue分布統(tǒng)計

當前第37頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第38頁\共有66頁\編于星期三\9點UniGene表達分析目的：UniGene定量分析。

原理：以UniGene為reference，分別將每個樣本的reads進行referencemapping,從而得到每個樣本在每個UniGenes中的一個reads覆蓋度，然后應用RPKM/FPKM標準化公式對富集片段的數(shù)量進行歸一化。

RPKM：ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads，公式下:當前第39頁\共有66頁\編于星期三\9點UniGene表達分布圖，1X，5X分別為FPKM=1，F(xiàn)PKM=5分界點，可以大體觀察到低表達，中表達以及高表達的比例關系當前第40頁\共有66頁\編于星期三\9點UniGene樣本間表達相關性散點圖當前第41頁\共有66頁\編于星期三\9點樣本間表達差異程度的MA圖，可以體現(xiàn)差異表達總體偏差當前第42頁\共有66頁\編于星期三\9點UniGene表達差異分析目的：對定量結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗分析，找出差異表達UniGene

原理：雙層過濾篩選差異基因

FC值篩選：采用Fold-change(FC)，表達差異倍數(shù)進行第一層此的差異基因篩選

FDR檢驗：一般采用卡方檢驗中的fisher精確檢驗進行p值檢驗，采用BenjaminiFDR(Falsediscoveryratio)校驗方法對p值進行假陽性檢驗，即，通過FDR顯著性參數(shù)進行第二層次的差異基因篩選。

當前第43頁\共有66頁\編于星期三\9點組間差異基因上調(diào)與下調(diào)個數(shù)統(tǒng)計，可以通過此圖觀察上調(diào)與下調(diào)的一個總體趨勢當前第44頁\共有66頁\編于星期三\9點差異基因火山圖，可以觀察到差異基因總體分布當前第45頁\共有66頁\編于星期三\9點GO功能分類

目的：利用數(shù)據(jù)庫注釋信息將UniGene進行GO功能分類。

原理：利用數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，應用blast2GO算法進行GO功能分類，得到所有序列在GeneOntology的三大類：molecularfunction,cellularcomponent,biologicalprocess的各個層次所占數(shù)目，一般取到14層。

結(jié)果：MF，BP，CC三大分類結(jié)果文件以及UniGene2GO關系列表，三大類別中第二層次上的柱狀分布圖和餅圖，GO功能的層次分布圖。

當前第46頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第47頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第48頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第49頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第50頁\共有66頁\編于星期三\9點KEGG代謝通路分析目的：對拼接得到UniGene進行KEGGpathway映射。

原理：應用KEGGKAAS在線pathway比對分析工具對拼接得到的UniGene進行KEGG映射分析。

結(jié)果：標記的Pathway通路圖。當前第51頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第52頁\共有66頁\編于星期三\9點IPApathwayanalysis

(/)當前第53頁\共有66頁\編于星期三\9點COG注釋目的：對拼接得到UniGene進行COG功能分類。

原理：利用blast+算法將拼接得到的UniGene與CDD庫中的COG/KOG庫進行比對，進行COG功能分類預測，將其映射到COG分類中。

結(jié)果：COG分類分布情況圖。當前第54頁\共有66頁\編于星期三\9點當前第55頁\共有66頁\編于星期三\9點SSR重復序列注釋目的：對拼接得到UniGene進行SSR簡單重復序列的查找。

原理：篩選標準：單核苷酸重復的次數(shù)在10次或10次以上，二核苷酸重復的次數(shù)在6次或6次以上，三至六核苷酸重復的次數(shù)在5次或5次以上。同時，也篩選中間被少數(shù)堿基(間隔小于100或等于100)打斷的不完全重復的SSR。

結(jié)果：重復序列的信息文件以及統(tǒng)計文件。

當前第56頁\共有66頁\編于星期三\9點LncRNA預測目的：對拼接得到的UniGene進行LncRNA(LongnoncodingRNA)預測。

原理：通過以下過程對UniGene進行過濾，最終得到候選LncRNA序列。

1)Unigenelength>200bp；

2)UnigeneORF(OpenReadingFrame)length<300；

3)將滿足長度條件的UniGene與多個近源物種進行進化分析，得到序列的保守性和進化特性；

4)根據(jù)上述的特性和已知數(shù)據(jù)庫中coding、noncoding區(qū)域的特性建立編碼篩選模型；

5)將符合noncoding模型的UniGene與