試驗六蛋白質(zhì)制備及含量測定—微量凱氏〔Mirco-Kjeldahl〕定氮法一、試驗?zāi)康囊?、了解蛋白質(zhì)提取的一般方法和原理2、了解蛋白質(zhì)含量測定的常用方法3、學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理4、把握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化、蒸餾、滴定、含氮量的計算及蛋白質(zhì)含量的換算等。二、試驗原理1〔研磨、超聲波等〕〔化學(xué)溶劑處理〕假設(shè)待提取的蛋白質(zhì)是具有生物活性的蛋白質(zhì)如酶，則在樣品處理、提取及分別純化2藍(lán)染色法〔Bradford法〕、Folin酚法、微量凱氏定氮法等。316因而被公認(rèn)為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。其原理如下：〔1〕快反響，添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點。這一步約需2 3h,視樣品的性質(zhì)而定。自然的含氮有機物〔如蛋白質(zhì)，核酸及氨基酸等〕與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二〔無機氮〕NH2-CH2-COOH+3H2SO4—NH3+2C6T+3S6T+402NH3+H2SO4—〔NH4〕2S04或2NH2-CH2-COOH+7H2SO4—〔NH4〕2S04+4CO2t+6SO2t+8H2O〔2〕加堿蒸餾：(NH4)2S04+2NaOH—Na2SO4+2NH3+20NH3+H3BO3NH4H2BO34 (3)4

2NH3+4H3BO3(NHB4O7+5H2O硼酸吸取氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。含量。NH4H2BO3+HCl—NH4CI+H3BO3或(NHBO+2HCI+5HO2NHCI+4HBO4 2 4 7 2 4 3 3滴定時用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2~5.6，將NH4H2BO3的綠色滴至原來H3BO3的紫色即為終點。0.2~1.0mg(2.0mg)氮量測定。相對誤差應(yīng)小于2%。3-1微量凱氏蒸餾裝置示意圖1熱源2.燒瓶3.玻璃管4.橡皮管5.玻璃杯6.棒狀玻塞7.反響室8.反響室外殼 9.10.反響室中插管11.12.13.石棉網(wǎng)3-2改進(jìn)型微量凱氏定氮蒸餾裝置1水蒸氣發(fā)生器2.3.水蒸氣排氣孔4.排水排氣孔5.外源水入口6.進(jìn)樣口7.8.冷凝9.冷凝器出口10.自來水入口11.12.通氣室出口13.通氣室出口14.15.排水柱入口16.排水柱入口17.冷凝水和廢水出口三、主要試驗試劑和器材1、試劑消化液(過氧化氫：濃硫酸：水=3:2:1)硫酸鉀一硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅(CuSO4 5H2O)以3:1(W/W)的配比混合研磨成粉末。30%氫氧化鈉溶液2%硼酸混合指示劑(田氏指示劑)的配制：方法一：取50mL0.1%200mL0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，或方法二:0.1%10mL0.1%2mL混和即成。本指示pH5.2—5.4—5.6(6)0.0100mol?L-1HCl[(7)硼酸—指示劑混合液：取

100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液1mL左右混合指示劑)]2、待測樣品市售面粉3、主要器材分析天平100mL(X2)350mL)41mL、2mL)凱氏定氮蒸餾裝置微量滴定管(3mL、5mL，可讀至0.02mL)(7)錐形瓶(50~100mL)四、操作方法1100克該物質(zhì)%105C100C以下烘干。105C4小時。用坩堝將1小時后，稱量一次，直到兩次稱量的數(shù)量不變，即達(dá)恒重(±0.0002g)。0.1g左右的枯燥面粉作為本次試驗的樣品。2、消化21000.1g面粉樣品。留意，加樣品時應(yīng)2號燒瓶參加0.1毫升蒸餾水作空白比照。在每個燒瓶內(nèi)參加硫酸鉀一硫酸銅混合物約0.2g,消化液(濃硫酸)5mL，玻璃珠160消化。在消化開頭時，應(yīng)掌握火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開頭分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強火力，使瓶內(nèi)液體微微沸騰，大約維持2~3h連續(xù)30％過氧化氫溶液1~21050毫升的容量用。留意事項1)留神加樣，切勿使樣品沾污凱氏燒瓶口部、頸部。245瓶頸壁上。3、蒸餾1口?！?〕〔以排水高度為宜〕〔〕〔虹吸〕；或移開蒸汽發(fā)生器的熱源〔如果幾種措施都無效，檢查裝置本身是否有問題如存在裂痕等〕。反復(fù)清洗3?5次。檢驗是否洗滌干凈：將一只盛有5mL2％硼酸液和1~2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液體中，蒸餾數(shù)分鐘，如硼酸液顏色不變，說明儀器已洗凈。否則連續(xù)洗滌直至洗凈為止。[〔3〕滴定標(biāo)準(zhǔn)樣品：標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液〔0.3毫克氮/毫升〕試驗2~3次。蒸餾器洗凈后，開放水龍頭，使水進(jìn)入蒸汽發(fā)生器，水放至球部即可。取3個50毫升的錐形瓶，各準(zhǔn)確參加10毫升硼酸〔內(nèi)加有混合指示劑〕。用外表皿復(fù)加樣：用吸量管吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液，細(xì)心地由加樣漏斗傾入反響室，再用蒸餾水1毫升清洗漏斗。取一個盛有硼酸—混合指示劑的錐形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝器管口下端浸沒在硼酸溶液液面下，用量筒從漏斗參加30%氫氧化鈉8mL，隨馬上自由夾夾緊，并往漏斗參加少量蒸餾水封閉。蒸餾：用酒精燈加熱〔應(yīng)用擋風(fēng)板將燈圍攏，維持火力恒定〕，沸騰不行高于虹吸管口以免整齊發(fā)生器溶液從虹吸管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱下端滴下時起，連續(xù)蒸餾 5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸2分鐘，并用少量蒸餾水冷凝管口外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨馬上蒸餾器洗凈。]〔3〕樣品消化液及空白的蒸餾取50mL錐形瓶數(shù)個，各加5mL2％硼酸溶液和1~2滴指示劑，用外表皿掩蓋備用。用吸量管分別吸取5mL/10mL樣品消化液按上述操作步驟進(jìn)展蒸餾。2下端，浸沒于液面下。5mL/10mL樣品消化液留神參加反響室。將預(yù)備好的30%氫氧化鈉8mL加1,加水封。關(guān)閉自由夾2,翻開冷凝水〔不要過猛〕加熱蒸汽發(fā)生器，開頭蒸餾。當(dāng)觀看到錐形瓶中由紫色一綠色〔2?3min〕,3min1min,用少量蒸餾水洗滌冷凝管下端外側(cè)。取下錐形瓶，以外表皿掩蓋。以備滴定。蒸餾完畢，應(yīng)馬上洗滌反響室，方法同前，清洗3?5次。連續(xù)進(jìn)展10mL空白消化蒸餾全部完畢后，將反響室清洗干凈，廢水排出?！?〕滴定：蒸餾完畢，分別用0.0100mol?L-1標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定樣品消化液蒸餾的錐別為V1和V2。留意事項〔1〕必需認(rèn)真檢查凱氏定氮儀的各個連接處，保證不漏氣?！?〕凱氏定氮儀必需事先反復(fù)清洗，保證干凈。〔3〕相通，避開參加的消化樣液發(fā)生倒吸。蒸餾時，切忌火力不穩(wěn)，否則也將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。蒸餾后應(yīng)準(zhǔn)時清洗定氮儀?；岬牡鞍踪|(zhì)測定結(jié)果偏高。一般試驗室中的空氣中常含有少量的氨、 C02,會影響結(jié)果，所以操作應(yīng)在單獨干凈的房間中進(jìn)展，并盡可能快地對硼酸吸取液進(jìn)展滴定?！?〕微量滴定管的使用：清洗干凈，用HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液潤洗；滴定時，留神操作，切勿HCl消耗量可能很小。五、試驗結(jié)果與分析CHCI(V1—V2)X0.014X100消化液總量樣品的總氮量〔克氮％〕=--------X %w 測定時用量〔如血清〕則：樣品的總蛋白含量〔克蛋白％〕=總氮量X6.25假設(shè)樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要更復(fù)雜一些。