胚胎發(fā)育與程序性細胞死亡演示文稿當前第1頁\共有73頁\編于星期四\8點（優(yōu)選）胚胎發(fā)育與程序性細胞死亡當前第2頁\共有73頁\編于星期四\8點蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程當前第3頁\共有73頁\編于星期四\8點2、簡史1885年，F(xiàn)lemming第一個描述有關(guān)細胞凋亡的特征；（染色質(zhì)濃縮形成半月形）1914年，Graper用這種死亡現(xiàn)象解釋胚胎發(fā)育中器官收縮等現(xiàn)象1951年，Glucksmann發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中存在這種死亡，并詳細描述；60年代，Lockshin和Williams首次提出‘‘程序性細胞死亡’’這一概念當前第4頁\共有73頁\編于星期四\8點1986年，Robert

Horvitz等發(fā)現(xiàn)線蟲中ced3（caspase），ced4（Apaf-1）是促凋亡基因。1980年，Wyllie等發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活有關(guān)。“DNAladder”是細胞凋亡發(fā)生的標志；1965年，JohnKerr提出“固縮性壞死”概念；1972年，Kerr，Wyllie，Currie提出“細胞凋亡”（apoptosis）的概念；當前第5頁\共有73頁\編于星期四\8點SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnSulston

THE2002NOBELPRIZEWINNER當前第6頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第7頁\共有73頁\編于星期四\8點王曉東：最年輕美國科學(xué)院院士從事的是細胞凋亡機制的研究。1996年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放細胞色素C,引起細胞凋亡;

2000年，發(fā)現(xiàn)線粒體釋放Smac，可促細胞凋亡.Smac:Secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase當前第8頁\共有73頁\編于星期四\8點袁鈞瑛，美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系終身教授，美國藝術(shù)和科學(xué)院院士，美國科學(xué)促進會會士。第一個細胞凋亡基因的發(fā)現(xiàn)者，其研究生導(dǎo)師Horvitz。當前第9頁\共有73頁\編于星期四\8點二、PCD/細胞凋亡的形態(tài)變化當前第10頁\共有73頁\編于星期四\8點(1)細胞皺縮變圓,微絨毛、復(fù)合體消失；出芽(budding)當前第11頁\共有73頁\編于星期四\8點膜空泡化（blebbing)出芽(budding)當前第12頁\共有73頁\編于星期四\8點(2)胞質(zhì)濃縮、細胞器結(jié)構(gòu)保留(3)核濃縮；染色質(zhì)凝聚當前第13頁\共有73頁\編于星期四\8點（4）形成凋亡小體當前第14頁\共有73頁\編于星期四\8點(4)凋亡小體形成胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)(內(nèi)含DNA物質(zhì)及細胞器)，形成的膜包顆粒即凋亡小體（apoptosisbody）

(5)吞噬當前第15頁\共有73頁\編于星期四\8點巨噬細胞吞噬凋亡小體巨噬細胞凋亡小體當前第16頁\共有73頁\編于星期四\8點三、PCD/細胞凋亡的生理和生化變化磷脂酰絲氨酸外翻：annexinV基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成：

與細胞骨架降解有關(guān)的酶:

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、組織蛋白酶D、組織型纖維蛋白酶原激活劑等

與凋亡小體形態(tài)維持有關(guān)的蛋白質(zhì):

簇因子、r-谷丙轉(zhuǎn)氨酶等Ca2+、Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶活化：

降解DNA，形成180-200bp或其倍數(shù)的DNA片段當前第17頁\共有73頁\編于星期四\8點PCD/細胞凋亡與壞死的區(qū)別★當前第18頁\共有73頁\編于星期四\8點細胞壞死(necrosis)

指由于某些外界毒性刺激（如局部缺血、高熱、物理和化學(xué)損傷或生物的侵襲等），直接作用于細胞導(dǎo)致的細胞急速死亡，一般伴有炎癥反應(yīng)。

一般過程：因補體反應(yīng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進入細胞，從而導(dǎo)致細胞吸水膨脹，最終破膜而死。當前第19頁\共有73頁\編于星期四\8點細胞凋亡與細胞壞死是多細胞生物細胞死亡的兩種不同形式，在形態(tài)學(xué)、生化代謝、分子機制、結(jié)局和意義等方面都有本質(zhì)的區(qū)別。

細胞壞死特征：溶酶體釋放酶，細胞器瓦解，細胞骨架降解，細胞核破裂、降解，蛋白質(zhì)合成終止，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)當前第20頁\共有73頁\編于星期四\8點圖8－2細胞凋亡與細胞壞死的比較當前第21頁\共有73頁\編于星期四\8點細胞壞死細胞凋亡1.性質(zhì)病理性生理性或病理性2.誘導(dǎo)因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能4.形態(tài)變化細胞腫脹、細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞胞膜及細胞器相對完整，細胞皺縮，核固縮5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈梯狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控無有表8－1細胞凋亡與細胞壞死的比較當前第22頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第23頁\共有73頁\編于星期四\8點三、胚胎發(fā)育中的程序性細胞死亡（PCD）

（一）PCD參與了各器官的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。1、肢體的發(fā)生2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育3、腭的發(fā)生4、管（腔）道的形成5、晶狀體的發(fā)育6、心的發(fā)育7、生殖細胞的發(fā)生8、免疫、造血系統(tǒng)的發(fā)生9、無用結(jié)構(gòu)的退化消失（弓動脈、前腎、中腎、尾芽、鰓膜等）當前第24頁\共有73頁\編于星期四\8點實驗將17期的雞胚翅芽后緣的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時仍發(fā)生死亡。將17期的雞胚翅芽后緣以外的細胞移植到另一不同胚齡雞胚的體節(jié)中，發(fā)育至24期時不發(fā)生死亡。證明雞胚翅芽后緣細胞的死亡有著預(yù)定的時間和空間程序。當前第25頁\共有73頁\編于星期四\8點（二）胚胎發(fā)育中PCD的意義1、系統(tǒng)匹配淘汰沒有作用或不再起作用的細胞，以確保有功能細胞的營養(yǎng)和空間。2、除去短暫結(jié)構(gòu)：人胚尾芽3、雕刻軀體從而形成正常、精細復(fù)雜的生物體。4、保護機體：如胸腺的發(fā)育、損傷的胚胎細胞當前第26頁\共有73頁\編于星期四\8點四、PCD/細胞凋亡的調(diào)節(jié)（一）激素水平的調(diào)節(jié)：甲狀腺素（蝌蚪）、糖皮質(zhì)激素（胸腺cell）、苗勒抑制物質(zhì)（中腎旁管）等誘導(dǎo)PCD雌激素（顆粒細胞）、FSH/LH（卵泡、生精細胞）、胰島素（晶狀體上皮細胞）等抑制PCD（二）細胞因子調(diào)節(jié)主要是生長因子：NGF，F(xiàn)GF，TGF，G-CSF等缺乏導(dǎo)致PCD當前第27頁\共有73頁\編于星期四\8點（三）PCD相關(guān)基因/蛋白的調(diào)節(jié)1、TNF死亡受體超家族（1）死亡受體：Fas、TNFRI等（2）與死亡受體有關(guān)的含死亡結(jié)構(gòu)域的信號蛋白：FADD（FAS相關(guān)死亡蛋白）、TRADD（TNFRI相關(guān)死亡蛋白）等當前第28頁\共有73頁\編于星期四\8點（1）死亡受體：Fas、TNFRI等結(jié)構(gòu)特點：

胞內(nèi)C-端：胞內(nèi)功能區(qū)由80個氨基酸構(gòu)成的死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD）

跨膜區(qū)

胞外N-端：胞外功能區(qū)內(nèi)含數(shù)個半胱氨酸當前第29頁\共有73頁\編于星期四\8點（2）含有死亡結(jié)構(gòu)域的信號蛋白TRADD（TNFR相關(guān)死亡蛋白）：34kD，C端的DD與TNFRI，F(xiàn)ADD的DD結(jié)合FADD（Fas相關(guān)死亡蛋白）

（MORT-1）：23kD，C-端含有一個DD(deathdomain)，可與Fas結(jié)合；N-端含有

MORT結(jié)構(gòu)域或死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED:deatheffectordomain），可與proCaspase-8（FLICE）的DED結(jié)合當前第30頁\共有73頁\編于星期四\8點Fas(Apo-1,CD95):43kD

（三聚體FasL-----Fas------FADD（Fas相關(guān)死亡蛋白）--------proCaspase-8）(

DISC/死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物):活化Bid、caspase-3

DED:deatheffectordomainTNFRI（TNFR55）：55-60kD，TNFRI-------TRADD（TNFR相關(guān)死亡蛋白）------FADD--------proCaspase-8

DDDEDDDDDDED當前第31頁\共有73頁\編于星期四\8點Fas/FasLDD:deathdomain當前第32頁\共有73頁\編于星期四\8點凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD當前第33頁\共有73頁\編于星期四\8點2.凋亡蛋白酶Caspase:

cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特異蛋白水解酶）一組對底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。(1)定義當前第34頁\共有73頁\編于星期四\8點（2）Caspase的分類及功能凋亡啟動亞類(DED、CARD)凋亡效應(yīng)亞類細胞因子加工亞類（ICE亞類）當前第35頁\共有73頁\編于星期四\8點Caspases激活的瀑布學(xué)說(級聯(lián)反應(yīng))當前第36頁\共有73頁\編于星期四\8點(3)結(jié)構(gòu)特征①以無活性的酶原形式存在；②N端均含有一段前區(qū)域（內(nèi)含DED、CARD)；CARD:CaspaseActivationandRecruitmentDomain當前第37頁\共有73頁\編于星期四\8點④在大亞基的C端含有一活性中心，其中半胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體；ActiveenzymeCatalyticsites當前第38頁\共有73頁\編于星期四\8點(4)

Caspase的作用底物①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具有內(nèi)切酶活性)ICADCADDNACaspase當前第39頁\共有73頁\編于星期四\8點②核纖層（lamina）蛋白細胞核lamina染色體當前第40頁\共有73頁\編于星期四\8點③細胞骨架蛋白：導(dǎo)致細胞解體，形成凋亡小體④其他的caspases⑤滅活細胞凋亡的抑制物當前第41頁\共有73頁\編于星期四\8點3、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1)

130kD，N-端含有一半胱氨酸蛋白酶募集域（CARD），C-端由12個WD-40重復(fù)片段組成。凋亡體/死亡復(fù)合體：

Cytc–Apaf1-dATP

（閉合的單體聚合成開放的七聚體）Cytc-Apaf1-dATP-proCaspase-9當前第42頁\共有73頁\編于星期四\8點凋亡復(fù)合體CARD:Caspase ActivationandRecruitmentDomain當前第43頁\共有73頁\編于星期四\8點4、線粒體膜間隙蛋白（線粒體釋放的凋亡相關(guān)因子）細胞色素C，凋亡誘導(dǎo)因子，Apaf-1,Ca2+,

Smac/DIABLO等5、自由基活性氧自由基（超氧陰離子自由基、羥自由基及單線態(tài)氧，H2O2等）：誘導(dǎo)PCD的發(fā)生?；钚缘杂苫篘O—高濃度促PCD，低濃度抑制PCD當前第44頁\共有73頁\編于星期四\8點6、P53基因阻滯細胞G1期，修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗則通過多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。（射線、毒素）分子警察當前第45頁\共有73頁\編于星期四\8點P53的促凋亡機制：（1）DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因（BAX等)轉(zhuǎn)錄（細胞核途徑）（2）激活線粒體途徑（3）誘導(dǎo)Fas增加（4）誘導(dǎo)溶酶體的不穩(wěn)定性當前第46頁\共有73頁\編于星期四\8點7、BcL-2家族3個亞家族抗凋亡蛋白亞家族（BcL-2亞家族）含多區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（Bax亞家族）僅含BH3區(qū)域的促凋亡蛋白亞家族（BH3亞家族）基本結(jié)構(gòu)特征：跨膜結(jié)構(gòu)域

BcL-2同源結(jié)構(gòu)域（BH）當前第47頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第48頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第49頁\共有73頁\編于星期四\8點

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族通過蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡。當前第50頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第51頁\共有73頁\編于星期四\8點Bcl-2（B

celllymphoma/leukemia-2）

：

Bcl-2

是第一個被確認有抗凋亡作用，由229aa構(gòu)成（鼠236）分布在線粒體膜,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等處。

Bcl-2

和C.elegans

中的ced-9

有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能。當前第52頁\共有73頁\編于星期四\8點BcL-2抗凋亡機制：①直接抗氧化；②調(diào)節(jié)PTP（線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔）開放；③抑制Bax，Bak的促凋亡作用；④抑制Caspases激活；⑤維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)。當前第53頁\共有73頁\編于星期四\8點8、凋亡抑制蛋白家族（IAP家族）IAP家族是一組抑制凋亡的蛋白。IAP家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)域：BIR

（baculoviralIAPrepeat),鋅指結(jié)構(gòu)域、CARD。BIR2是IAP

抑制凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。作用機制：抑制caspase-3,7等的活性。當前第54頁\共有73頁\編于星期四\8點Figure1SchematicdiagramofdomainstructureinrepresentativeIAPs當前第55頁\共有73頁\編于星期四\8點凋亡細胞DNA的斷裂形成高分子量的DNA大片斷（50kb)形成180－200bp整數(shù)倍的DNA小片斷非Caspase依賴的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活Caspase依賴的內(nèi)源性核酸酶激活(CAD)9.核酸內(nèi)切酶當前第56頁\共有73頁\編于星期四\8點Caspase8

Caspase3Caspase9CleavageofsubstratesNucleusDegradationofDNACAD激活方式細胞膜當前第57頁\共有73頁\編于星期四\8點DNA斷裂與“梯狀條帶”R當前第58頁\共有73頁\編于星期四\8點DNA“梯”狀條帶當前第59頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第60頁\共有73頁\編于星期四\8點當前第61頁\共有73頁\編于星期四\8點（二）、PCD的主要途徑1.膜受體通路(死亡受體通路/外源性通路)腫瘤壞死因子死亡受體(TNFR)家族中的死亡受體：Fas／CD95，TNFR當前第62頁\共有73頁\編于星期四\8點Fas/FasLDD:deathdomain當前第63頁\共有73頁\編于星期四\8點死亡受體通路凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD當前第64頁\共有73頁\編于星期四\8點2.線粒體通路（內(nèi)源性途徑）線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）：由內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道）構(gòu)成的蛋白復(fù)合體。當前第65頁\共有73頁\編于星期四\8點R當前第66頁\共有73頁\編于星期四\8點1、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞與細胞凋亡的一致性；

Δψm下降時PTP開放導(dǎo)致細胞凋亡

Δψm正常時無細胞凋亡

2、線粒體跨膜電位（Δψm）的破壞早于核DNA的斷裂。當前第67頁\共有73頁\編于星期四\8點??線粒體信號通路smacSmac:secondmitochondria-derivedactivatorofcaspaseIAPs(-)ApoptosisinducingfactorInhibitorsofapoptosisprotei