胚胎工程實驗之體外受精演示文稿當(dāng)前第1頁\共有129頁\編于星期四\8點（優(yōu)選）胚胎工程實驗之體外受精當(dāng)前第2頁\共有129頁\編于星期四\8點對畜牧業(yè)生產(chǎn)、動物生殖機理的研究及保護瀕危動物、治療人類的不孕不育癥等具有重要意義可望解決胚胎移植所需胚胎的生產(chǎn)成本及來源匿乏等關(guān)鍵問題。可利用IVM－IVF－IVC體外大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量的胚胎，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉的胚胎，大大加速品種改良進程。體外受精的意義當(dāng)前第3頁\共有129頁\編于星期四\8點能為動物克隆和轉(zhuǎn)基因等其他胚胎生物技術(shù)提供豐富的實驗材料和必要的研究手段充分挖掘優(yōu)良公母畜的繁殖潛力評定家畜精子的質(zhì)量當(dāng)前第4頁\共有129頁\編于星期四\8點1978年英國當(dāng)前第5頁\共有129頁\編于星期四\8點由于正常受精過程的完成需要一個完全成熟的卵子和一個獲得受精能力的精子，且其受精后需對其進行培養(yǎng)才能發(fā)育成為一個可移植的胚胎，因此，從廣義上講，體外受精技術(shù)又包含卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)、精子的體外獲能、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)等多項密切相關(guān)的技術(shù)。當(dāng)前第6頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第7頁\共有129頁\編于星期四\8點一、實驗?zāi)康氖煜ば凼蟮纳称鞴俚慕Y(jié)構(gòu)特點；掌握從輸卵管上取成熟卵母細胞的方法；掌握從附睪尾部取精子的方法、精子的體外獲能和體外受精方案、受精率的觀察。當(dāng)前第8頁\共有129頁\編于星期四\8點二、實驗器材和材料1.器材及藥品體視顯微鏡，手術(shù)器械，1mL注射器，膠頭滴管，口吸管，CO2培養(yǎng)箱，水浴鍋，移液器，槍頭，塑料培養(yǎng)皿，記號筆，血細胞計數(shù)板、載玻片、蓋玻片。0.1％透明質(zhì)酸酶，卵母細胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培養(yǎng)液（CZB，有糖和無糖）、激素（PMSG和HCG），石蠟油。當(dāng)前第9頁\共有129頁\編于星期四\8點2．實驗動物3-4周齡昆明系雌性小白鼠和8-12周齡雄鼠，自由采食飲水，控光一周以上，暗光時間20：00-6：00；光照時間6：00-20：00。當(dāng)前第10頁\共有129頁\編于星期四\8點三、實驗內(nèi)容當(dāng)前第11頁\共有129頁\編于星期四\8點1．體內(nèi)成熟卵母細胞的獲取超排方法：15：00腹腔注射PMSG10IU/只小鼠。48小時后腹腔注射hCG10IU/只。注射hCG后14-15h，利用頸椎脫臼法處死小鼠（方法同實驗一），取輸卵管于M2操作液中，清洗兩次，在體視顯微鏡下用眼科鑷子撕開輸卵管壺腹部釋放出卵丘卵母細胞復(fù)合體團，用口吸管吹打幾次，把COC團分散開。當(dāng)前第12頁\共有129頁\編于星期四\8點IVM卵母細胞（小鼠）當(dāng)前第13頁\共有129頁\編于星期四\8點2．體外受精2．1取附睪尾部精子選取性成熟（>8周）昆明白雄鼠，已通過交配實驗證明其有受精能力，頸椎脫臼法殺雄鼠，打開腹腔，將附睪尾部和輸精管剪下，剔除脂肪，在實體顯微鏡下，用鑷子和針頭配合，擠出輸精管內(nèi)精子。針頭刺破附睪尾部上皮，擠壓出精子（圖2-1）。當(dāng)前第14頁\共有129頁\編于星期四\8點大鼠（公）當(dāng)前第15頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第16頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第17頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第18頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第19頁\共有129頁\編于星期四\8點2．2精子的洗滌在小鼠上可省略（從附睪尾部取精子），但在大動物上必需（射出精液），洗滌可除去獲能抑制因子、卵黃、甘油等。當(dāng)前第20頁\共有129頁\編于星期四\8點2．3精子的獲能馬上收集精子團塊，置于1.5mL離心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的T6，輕微振蕩幾次，使精子團分散開，用封口膜封口，于37.5℃，5％CO2，95％空氣，100％濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中孵育1.5h左右。當(dāng)前第21頁\共有129頁\編于星期四\8點發(fā)展中的南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎工程技術(shù)中心當(dāng)前第22頁\共有129頁\編于星期四\8點2．4精液品質(zhì)檢測主要檢測活力和密度，方法參考《動物繁殖學(xué)實驗教程》。當(dāng)前第23頁\共有129頁\編于星期四\8點附：精液品質(zhì)檢查精液品質(zhì)檢查(semenqualitymeasurement)是為了鑒別精液質(zhì)量的優(yōu)劣。評定的各項指標(biāo)，既是確定精液取舍、新鮮精液進行稀釋保存的依據(jù)，又能反映雄性動物飼養(yǎng)管理水平和其生殖器官的機能狀態(tài)。因此，常用作診斷公畜不育或確定其種用價值的重要手段，同時也是衡量精液在稀釋、保存和運輸過程中的品質(zhì)變化和處理效果的重要判斷依據(jù)。當(dāng)前第24頁\共有129頁\編于星期四\8點指標(biāo)精子活力(motility)精子活力是指精液中呈前迸運動的精子所占百分率，也稱活率。由于它與精子的受精能力直接相關(guān)，所以是評價精液品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。通常在采精后，精液處理前、后，冷凍精液解凍后和輸精前進行檢查

精子密度每mL中精子的數(shù)目（細胞計數(shù)板）當(dāng)前第25頁\共有129頁\編于星期四\8點精子頂體異常率(abnormalacrosomerate)：精子頂體在受精過程中具有重要作用，一般認(rèn)為只有呈前進運動、且頂體完整的精子才具有正常受精能力。當(dāng)前第26頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第27頁\共有129頁\編于星期四\8點精子畸形率(ASR)：凡形態(tài)和結(jié)構(gòu)不正常的精子通稱為畸形精子。在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不會超20%。優(yōu)質(zhì)精液，精子畸形率不能超過如下數(shù)值:牛18%，水牛15%，羊14%，豬18%，馬12%，當(dāng)前第28頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第29頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第30頁\共有129頁\編于星期四\8點2．5體外受精將成熟的COC移入已經(jīng)平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1×106右，置于培養(yǎng)箱中孵育8h，觀察原核形成和第二極體排出，計算受精率。當(dāng)前第31頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第32頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第33頁\共有129頁\編于星期四\8點體外受精質(zhì)量的評定體外受精成功的判斷指標(biāo)：精子穿透率原核形成率卵裂率囊胚率通過染色或胚胎培養(yǎng)當(dāng)前第34頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第35頁\共有129頁\編于星期四\8點3．胚胎培養(yǎng)洗去精子，將胚胎換液于無糖CZB繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎過阻斷之后（4－cell）換為含葡萄糖的CZB，換液時間在有1/3的胚胎到達4－cell后進行，大約在受精后36h－48h之間。在受精后24h、48h、72h、96h各觀察一次，記錄2－cell、4－cell、桑椹胚、囊胚的發(fā)育情況。當(dāng)前第36頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第37頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第38頁\共有129頁\編于星期四\8點四、作業(yè)1．計算本實驗的受精率、卵裂率和囊胚發(fā)育率。鼠號卵數(shù)受精率卵裂率囊胚率當(dāng)前第39頁\共有129頁\編于星期四\8點2．簡述實驗中的注意事項。3．簡述體外受精的步驟。當(dāng)前第40頁\共有129頁\編于星期四\8點THANKS!當(dāng)前第41頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第42頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第43頁\共有129頁\編于星期四\8點哺乳動物正常體內(nèi)受精＋＝為了提高動物繁殖率，家畜體外受精技術(shù)在20世紀(jì)80年代初研究成功，并在近10年得到逐步完善。

體外受精（IVF）：指用經(jīng)特殊處理的精子在體外使卵母細胞受精的技術(shù)。經(jīng)IVF-ET所生的嬰兒稱試管嬰兒。精子受精卵卵子生殖細胞的收集精子卵母細胞卵母細胞體外成熟培養(yǎng)受精受精卵的體外培養(yǎng)精子體外獲能二、體外受精概述當(dāng)前第44頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第45頁\共有129頁\編于星期四\8點發(fā)情周期觀察－超排－活體取卵－（或屠宰場卵巢－卵母細胞的體外成熟）采精－精液品質(zhì)檢測－精子體外獲能體外受精（或ICSI）－胚胎質(zhì)量檢測－胚胎移植－妊娠－分娩技術(shù)流程當(dāng)前第46頁\共有129頁\編于星期四\8點卵子的收集和處理體內(nèi)：（超排后從卵巢或輸卵管內(nèi)）體外：屠宰場的卵巢本實驗用小鼠卵巢當(dāng)前第47頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第48頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第49頁\共有129頁\編于星期四\8點Eggretrieval,detailview

當(dāng)前第50頁\共有129頁\編于星期四\8點未成熟卵母細胞當(dāng)前第51頁\共有129頁\編于星期四\8點脫去卵丘的未成熟卵母細胞當(dāng)前第52頁\共有129頁\編于星期四\8點GVBD當(dāng)前第53頁\共有129頁\編于星期四\8點成熟的卵母細胞當(dāng)前第54頁\共有129頁\編于星期四\8點IVM卵母細胞（小鼠）當(dāng)前第55頁\共有129頁\編于星期四\8點放射冠透明帶卵質(zhì)膜卵母細胞極體132當(dāng)前第56頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第57頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第58頁\共有129頁\編于星期四\8點精子入卵的三道屏障：擴展的卵丘透明帶卵質(zhì)膜弱精、畸精、少精癥患者的精子很難穿越三道屏障當(dāng)前第59頁\共有129頁\編于星期四\8點卵巢卵巢大多呈卵圓形，都成對存在。由于各級卵泡及排卵后出現(xiàn)的一系列變化，致使牛、豬卵巢表面凹凸不平。卵巢位置是半游離的，系于卵巢系膜上。豬：青年豬為橢圓形，較??；多胎次后呈葡萄串狀。當(dāng)前第60頁\共有129頁\編于星期四\8點卵巢為實質(zhì)器官，實質(zhì)為各級卵泡，包括原始卵泡、初級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡。原始卵泡數(shù)量很多，但能成熟的卵泡很少，絕大部分退化成為閉鎖卵泡。成熟卵泡排出卵細胞后，形成紅體，隨后形成黃體。黃體退化后由結(jié)締組織填充，而成為白體。當(dāng)前第61頁\共有129頁\編于星期四\8點2.1.1卵泡發(fā)育和排卵卵巢皮質(zhì)部表層聚集著許多原始卵泡，由一個卵原細胞和周圍的單層扁平卵泡細胞組成。成熟：隨著卵泡的發(fā)育，經(jīng)過初級卵泡、次級卵泡、生長卵泡和成熟卵泡階段，卵原細胞經(jīng)過初級卵母細胞、次級卵母細胞，最終發(fā)育為卵子，由卵巢排出。當(dāng)前第62頁\共有129頁\編于星期四\8點黃體及白體當(dāng)前第63頁\共有129頁\編于星期四\8點子宮子宮是胎兒生長發(fā)育和娩出的器官。子宮(uterus)大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。背側(cè)為直腸。腹側(cè)為膀胱，前接輸卵管，后接陰道，借助于子宮闊韌帶懸于腰下腹腔。子宮角－－子宮體－－子宮頸當(dāng)前第64頁\共有129頁\編于星期四\8點牛的子宮當(dāng)前第65頁\共有129頁\編于星期四\8點豬的子宮當(dāng)前第66頁\共有129頁\編于星期四\8點2.卵子發(fā)生卵子是受精的基礎(chǔ)，作為配子的一方，在卵泡中逐漸發(fā)育成熟。精子：提供遺傳物質(zhì)卵子：提供遺傳物質(zhì)，提供支持早期胚胎發(fā)育的營養(yǎng)當(dāng)前第67頁\共有129頁\編于星期四\8點2.1卵子形態(tài)結(jié)構(gòu)哺乳動物的卵子為圓球形，其直徑大小因所含的卵黃量不同，變異范圍較大，透明帶內(nèi)卵黃的直徑為80－200um，為精子體積的1萬倍。家畜卵的直徑一般小于185um，牛為120－140um，綿羊140－185um，豬120－170um。當(dāng)前第68頁\共有129頁\編于星期四\8點雌性生殖細胞的分化、增殖、成熟全過程稱為卵子發(fā)生(oogenesis)。卵子發(fā)生起始于胚胎早期，由原始卵原細胞經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂最后成為單倍體的卵細胞，持續(xù)時間很長，一般在初情期以后開始，至受精過程中才能完成。當(dāng)前第69頁\共有129頁\編于星期四\8點2.2卵子發(fā)生特點卵子發(fā)生和精子發(fā)生的過程很相似，都要經(jīng)過增殖期、生長期和成熟期三個階段，但與精子發(fā)生相比也有許多不同之處。首先，卵原細胞經(jīng)過有絲分裂的增殖形成初級卵母細胞，初級卵母細胞經(jīng)過兩次減數(shù)分裂，每次分裂均生成大小不等的兩個細胞，小的稱為極體。多余的染色體被排出，最后形成一個成熟的卵子。當(dāng)前第70頁\共有129頁\編于星期四\8點其次，哺乳動物的卵原細胞分裂形成初級卵母細胞都是在胎兒出生以前或出生后不久完成的。在動物性成熟以前，卵母細胞不再增長，停留在第一次減數(shù)分裂前期。到性成熟以后，每個性周期都會有部分卵母細胞發(fā)育，但多數(shù)卵母細胞在發(fā)育過程中退化，只有少數(shù)卵母細胞發(fā)育到成熟并排卵。當(dāng)前第71頁\共有129頁\編于星期四\8點卵母細胞在生長發(fā)育過程中要積累大量的營養(yǎng)物質(zhì)和遺傳信息，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)和信息。盡管哺乳動物的胚胎是在母體子宮內(nèi)發(fā)育，可以直接吸收母體的營養(yǎng)物質(zhì)，不像鳥類、兩棲類、爬行類動物的卵需要存貯大量的卵黃物質(zhì)，但一些母源性mRNA.tRNA.rRNA的合成還是必需的。當(dāng)前第72頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第73頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第74頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第75頁\共有129頁\編于星期四\8點三、卵的采集及體外成熟（實驗）

1.卵母細胞的離體采集母畜屠宰后，在30min內(nèi)取出卵巢，放入盛有滅菌生理鹽水或PBS的保溫瓶內(nèi)（25－35℃）中，在3h內(nèi)送回實驗室，然后按照下述方法進行回收。①卵泡抽吸法：用注射器套上12－16號針頭，保持一定負壓，從卵泡的側(cè)面刺入，一次進針可抽吸卵巢皮質(zhì)的多個卵泡。②卵泡解剖法：用手術(shù)刀片將卵巢切為兩半，去掉中間的髄質(zhì)部分，露出卵泡，然后用刀片劃破卵泡，在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗，采集其中的卵母細胞。（一）卵母細胞的采集方法當(dāng)前第76頁\共有129頁\編于星期四\8點2.卵母細胞的活體采集因從屠宰場收集得到的卵巢無法知道其系譜，且其種質(zhì)一般相對較差，所以卵母細胞的活體采集是通過體外受精技術(shù)生產(chǎn)良種胚胎的一種主要途徑。如今，活體采卵已成為當(dāng)今應(yīng)用體外受精和胚胎移植的一項關(guān)鍵技術(shù)。①腹腔鏡法：②B型超聲波法：當(dāng)前第77頁\共有129頁\編于星期四\8點Eggretrieval,ultrasoundimage

當(dāng)前第78頁\共有129頁\編于星期四\8點GIFTprocedure,gameteintrafal-lopiantransfer,laparoscopy配子輸卵管內(nèi)移植（GIFT）當(dāng)前第79頁\共有129頁\編于星期四\8點（二）卵母細胞的篩選

只有周圍包被著完整卵丘（A級）或部分卵丘脫落（B級）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細胞才能進行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。當(dāng)前第80頁\共有129頁\編于星期四\8點（三）卵母細胞的體外成熟方法

37-39度，5％二氧化碳，100％濕度

1.成熟培養(yǎng)液的選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)液TCM199中的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤等對卵母細胞核成熟有抑制作用的成分濃度較低，培養(yǎng)的效果相對較好。體外成熟培養(yǎng)卵母細胞還要在基礎(chǔ)液加入一定濃度的血清（5％－10％的FCS或ECS）和促性腺素（0.1－1.0μg/mlFSH和5－10μg/mlLH等）等成分。2.成熟培養(yǎng)的時間對大多數(shù)家畜來講，卵母細胞的成熟培養(yǎng)時間一般采用22－24h，但是也要依據(jù)動物而定。當(dāng)前第81頁\共有129頁\編于星期四\8點3.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境溫度：目前，除人和嚙齒類動物的卵母細胞體外成熟仍采用37℃外，牛、豬、羊和馬等家畜的卵母細胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38－39℃。氣象環(huán)境：CO2的濃度：應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽來定。由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25－30mmol/L，故一般都采用5％的CO2。4.成熟培養(yǎng)的系統(tǒng)大致可分為三大類。①開放培養(yǎng)系統(tǒng)：將1－2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平面皿內(nèi)或五孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后放入50－200枚卵母細胞進行培養(yǎng)，上面不覆蓋石蠟油。當(dāng)前第82頁\共有129頁\編于星期四\8點

②微滴培養(yǎng)系統(tǒng)：將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50－500μl的微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細胞置于其中培養(yǎng)。在一般情況下，這種培養(yǎng)液用在卵母細胞數(shù)量特別少的情況下采用。③密閉培養(yǎng)系統(tǒng)：將卵母細胞置于含有1－2ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一個密閉的塑料袋內(nèi)。當(dāng)前第83頁\共有129頁\編于星期四\8點IVF,invitrofertilization,process

當(dāng)前第84頁\共有129頁\編于星期四\8點受精是兩性配子(精子和卵子)相互作用，結(jié)合產(chǎn)生新的個體即合子(zygote)的過程。

通過受精，單倍體的雌、雄生殖細胞共同構(gòu)成雙倍體的合子(又稱受精卵)，合子是新生命發(fā)育的起點。哺乳動物受精部位：輸卵管壺腹部。當(dāng)前第85頁\共有129頁\編于星期四\8點有極少數(shù)的精子到達輸卵管壺腹部。主要是由于精子從射精部位到達受精部位需要闖過三道關(guān)卡，即經(jīng)過三次篩選：第一道關(guān)卡——子宮頸。第二道關(guān)卡——子宮內(nèi)膜腺。第三道關(guān)卡——輸卵管壺腹部和峽部的連接部。當(dāng)前第86頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第87頁\共有129頁\編于星期四\8點剛射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性生殖道內(nèi)度過一段時間之后，才獲得受精能力，稱為“獲能”(capacitation)。三、精子獲能當(dāng)前第88頁\共有129頁\編于星期四\8點精子獲能后，能釋放出一系列水解酶，可將包圍在卵子周圍的細胞和生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)和黏多糖)溶解出一條通路，便于精子進入卵母細胞。獲能過程先在子宮內(nèi)進行，最后在輸卵管內(nèi)完成。當(dāng)前第89頁\共有129頁\編于星期四\8點頂體反應(yīng)(acrosomereaction)：包裹精子頭部的質(zhì)膜、頂體外膜融合和破裂，釋放頂體內(nèi)含物的過程。這一反應(yīng)是精子與卵子融合前必須經(jīng)歷的反應(yīng)之一，也是精子獲能后的必然結(jié)果。四、頂體反應(yīng)當(dāng)前第90頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第91頁\共有129頁\編于星期四\8點受精過程始于精子與卵子相遇，兩性原核合并形成合子時結(jié)束，分為五個步驟：精子穿過放射冠精子穿過透明帶精子穿過卵質(zhì)膜原核形成配子配合五、受精的過程當(dāng)前第92頁\共有129頁\編于星期四\8點原核形成精子入卵后不久，頭部開始膨大，核疏松，核膜消失，失去固有的形態(tài)，最后在疏松的染色質(zhì)外又形成新的核膜，這種重新形成的核叫雄原核。同時卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)，釋放第二極體。卵中的染色質(zhì)外又形成新的核膜，稱雌原核。當(dāng)前第93頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第94頁\共有129頁\編于星期四\8點配子配合雄原核和雌原核經(jīng)充分發(fā)育，逐漸相向移動。在卵子中央，核仁和核膜消失，兩原核緊密接觸，然后迅速收縮，染色體重新組合，并準(zhǔn)備進行第一次有絲分裂，形成一個稱為“合子”的單細胞胚胎。當(dāng)前第95頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第96頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第97頁\共有129頁\編于星期四\8點第二節(jié)體外受精一、概述二、精子的制備及獲能三、卵的采集及體外成熟四、體外受精的方法五、體外受精質(zhì)量的評定六、早期胚胎的體外培養(yǎng)七、影響體外受精的因素當(dāng)前第98頁\共有129頁\編于星期四\8點1998年我國首例試管嬰兒誕生10周年時，張麗珠與鄭萌珠在一起。北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院當(dāng)前第99頁\共有129頁\編于星期四\8點2.歷史1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生，這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。而早在1878年，德國科學(xué)家Schenk就開始進行哺乳動物卵子體外受精的嘗試。1890年，Heape用人工授精和體外受精技術(shù)研究兔的胚胎移植，胚胎可成功發(fā)育直至降生。當(dāng)前第100頁\共有129頁\編于星期四\8點直至20世紀(jì)40年代，世界上也只有為數(shù)不多的科學(xué)家能成功的進行哺乳動物體外受精試驗。美國的Pincus和日本的Yamane是這時期的代表。美籍華人張明覺在1945年曾成功的進行了兔體外受精，但在此后的5年里沒有能再重復(fù)出這一結(jié)果。這個時期的體外受精工作主要建立在經(jīng)驗基礎(chǔ)上。當(dāng)前第101頁\共有129頁\編于星期四\8點1951年，Chang和澳大利亞的Austin幾乎同時發(fā)現(xiàn)只有在雌性生殖道內(nèi)停留一段時間的精子才能成功的與卵結(jié)合，進行體外受精。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)是體外受精史上的一個里程碑。1959年，Chang利用體內(nèi)獲能處理的精子進行體外受精實驗，獲得世界上首例“試管動物”——試管兔，為哺乳動物體外受精工程奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前第102頁\共有129頁\編于星期四\8點

1963年，Yanagimachi和Chang首次報道了成功進行精子體外獲能的實驗（金黃倉鼠）。1970年，Mukherjee和Cohen，小鼠。1978年7月25日，第一例試管嬰兒LouiseBrown在英國誕生（Steptoe和Edwards），這是體外受精技術(shù)走向全面應(yīng)用的標(biāo)志性事件，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上的一次偉大的革命。當(dāng)前第103頁\共有129頁\編于星期四\8點1989年，陳大元等首次成功進行大熊貓精子體外獲能，體外獲能的大熊貓精子能與金黃地鼠卵子相互作用。1990年，Miller和Ax相繼進行了美洲虎和美洲豹的體外受精，并于同年獲得美洲虎體外受精后代。當(dāng)前第104頁\共有129頁\編于星期四\8點80年代以來，由于對胚胎需求量的加大，促進了家畜體外受精的研究，牛、羊、豬等相繼獲得了成功，國內(nèi)在80-90年代也在家畜上取得了成功。

現(xiàn)已將卵母細胞體外成熟—體外受精—早期胚體外發(fā)育，甚至冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉的胚胎。當(dāng)前第105頁\共有129頁\編于星期四\8點與人工授精相比，體外受精所需精子數(shù)減少，精液利用率提高。當(dāng)前第106頁\共有129頁\編于星期四\8點二、精子的制備及獲能

1.取精當(dāng)前第107頁\共有129頁\編于星期四\8點大鼠（公）當(dāng)前第108頁\共有129頁\編于星期四\8點2.精子的分離與制備是IVF的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)精液中的精子獲能抑制因子冷凍精液中的防凍劑和蛋黃等成分

影響和干擾受精的完成過多的留在受精液中的死精子

當(dāng)前第109頁\共有129頁\編于星期四\8點①懸浮法（swimup）：是篩選高活力精子最為有效的一種方法。②玻璃棉（glasswool）過濾法：該法可有效地濾除品質(zhì)較差精液中的死精子，大大提高精子的受精穿透率。方法：當(dāng)前第110頁\共有129頁\編于星期四\8點③BSA/哌可（Percoll）密度梯度離心法：采用不連續(xù)的BSA密度梯度可以分離得到形態(tài)正常的高活力精子。④離心洗滌法：對于精子活力較好的精液可采用直接離心洗滌法制備用于體外受精的精子。當(dāng)前第111頁\共有129頁\編于星期四\8點3.精子獲能原理任何可導(dǎo)致精子被膜蛋白脫除，質(zhì)膜穩(wěn)定性下降，通透性增加和Ca2+

內(nèi)流的處理方法，均能誘發(fā)精子的獲能。精子獲能后發(fā)生一系列明顯變化，代謝活動顯著增強，攝氧量增加2-4倍，運動速度加快，頭部膨大，極易發(fā)生頂體反應(yīng)。當(dāng)前第112頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第113頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第114頁\共有129頁\編于星期四\8點母畜生殖道內(nèi)的獲能因子中和精子表面的去能因子精子質(zhì)膜的膽固醇外流Ca2+進入精子內(nèi)部膜的通透性增加獲能完成

膜蛋白重新分布，膜的穩(wěn)定性下降cAMP濃度升高激活腺苷酸環(huán)化酶抑制磷酸二酯酶當(dāng)前第115頁\共有129頁\編于星期四\8點體內(nèi)獲能：把精子送入結(jié)扎的子宮角或輸卵管中孵育

①與血清白蛋白的溶液長時間孵育：原理是血清中白蛋白具有很強結(jié)合膽固醇和鋅離子的能力，可除去質(zhì)膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子獲能。②用高離子強度溶液處理精子：精子表面的去能因子（被膜蛋白），當(dāng)用高離子強度溶液處理精子時，將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。③與含有卵泡液的培養(yǎng)液進行孵育：

4.精子體外獲能的方法當(dāng)前第116頁\共有129頁\編于星期四\8點④使用鈣離子載體A23187：

直接誘發(fā)Ca2+進入精子細胞內(nèi)部，提高細胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而導(dǎo)致精子獲能。⑤使用肝素：是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，當(dāng)它與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進入精子細胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子的獲能。是一種接近于體內(nèi)獲能的生理性方法，已經(jīng)成為動物體外受精應(yīng)用最廣的一種精子獲能方法。當(dāng)前第117頁\共有129頁\編于星期四\8點四、體外受精的方法

體外受精的完成需要一個有利于精子和卵子存活的培養(yǎng)系統(tǒng)。①微滴法：是在塑料培養(yǎng)皿中用受精液做成20－40μl的微滴，上覆石蠟油，然后每滴放入體外成熟的卵母細胞10－20枚及獲能處理的精子（1.0－1.5）×106個/ml，在培養(yǎng)箱中孵育6－24h。當(dāng)前第118頁\共有129頁\編于星期四\8點②四孔培養(yǎng)板法：每孔加入500μl受精液和100－150枚體外成熟的卵母細胞，然后加入獲能處理的精子（1.0－1.5）×106個/ml，而后在培養(yǎng)箱中孵育6－24h。

當(dāng)前第119頁\共有129頁\編于星期四\8點五、體外受精質(zhì)量的評定體外受精成功的判斷指標(biāo)：精子穿透率原核形成率卵裂率囊胚率通過染色或胚胎培養(yǎng)當(dāng)前第120頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第121頁\共有129頁\編于星期四\8點當(dāng)前第122頁\共有129頁\編于星期四\8點六、早期胚胎的體外培養(yǎng)

對于一些采用非手術(shù)法將胚胎移植的家畜來說，體外受精后的早期胚胎必須在體外培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段才能移植；而對于那些采用手術(shù)法移植胚胎的動物，將受精卵培養(yǎng)成囊胚再移植，亦有可