2022卵巢儲(chǔ)備功能下降小鼠模型研究進(jìn)展(全文)摘要卵巢儲(chǔ)備功能下降(decreasedovarianreserve,DOR)損害女性身心健康。因倫理原因，難以對(duì)人體卵巢組織進(jìn)行研究，構(gòu)建DOR動(dòng)物模型是解決這一難題的辦法。構(gòu)造DOR動(dòng)物模型有助于研究其病理生理及探索治療措施。目前構(gòu)建小鼠DOR模型的方法主要有：使用藥物(化療藥物、干擾代謝類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等X射線照射、基因工程、環(huán)境毒物損傷等，這些造模方法各具特點(diǎn)，其中注射化療藥物環(huán)磷酰胺是建立DOR小鼠模型的一種較好的方法，具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、周期快、效果確切、易重復(fù)、卵巢損傷程度可控的優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)DOR小鼠常用建模方法的原理及特點(diǎn)進(jìn)行綜述。卵巢儲(chǔ)備功能下降(decreasedovarianreserve,DOR)是指女性卵巢卵泡數(shù)量減少，或伴有質(zhì)量下降，導(dǎo)致月經(jīng)周期紊亂、經(jīng)量減少、閉經(jīng)、生育力下降甚至不孕等一系列臨床表現(xiàn)的生殖系統(tǒng)病變。DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)為卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)>10U/L或抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)<1.0pg/L[1LDOR在不孕癥人群中發(fā)病率約為10%[2]，近年來(lái)有增高趨勢(shì)。DOR病因尚未完全清楚，與年齡、放化療、手術(shù)損傷、煙酒等不良嗜好以及遺傳因素等有關(guān)，部分患者原因不明。目前DOR尚無(wú)有效的治療方法，戒除煙酒嗜好、調(diào)整月經(jīng)周斷使用抗氧化劑,有生育需求者采用誘導(dǎo)排卵或輔助生殖技術(shù)，以期達(dá)到對(duì)癥治療。因此，探索DOR的病因、病理改變、發(fā)病機(jī)制、治療措施有望對(duì)疾病的治療取得突破性進(jìn)展。但受倫理限制，難以用人的卵巢組織進(jìn)行研究，DOR動(dòng)物模型有助于解決這一難題。目前國(guó)內(nèi)夕卜文獻(xiàn)才艮道了多種dor動(dòng)物模型造模方法，國(guó)內(nèi)已有DOR動(dòng)物模型相關(guān)綜述［3］,但是動(dòng)物種類未統(tǒng)一，具體造模方法的劑量、異同點(diǎn)比較、是否可逆等有待深入闡述。DOR造模最常用的動(dòng)物是6?8周齡小鼠。Kalantaridou等［4］1998年提出切除小鼠胸腺建立自身免疫型DOR小鼠模型之后國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了多種建模方法。不論何種方法造模DOR小鼠均出現(xiàn)以下特征性改變：動(dòng)情周期紊亂或消失，自然受孕率下降；卵巢萎縮、體積變小、重量減輕、蒼白；顯微鏡下見卵巢組織卵泡減少、血管稀疏、間質(zhì)增生，閉鎖卵泡數(shù)目增加，卵母細(xì)胞內(nèi)形成空泡；血液中雌二醇水平下降、FSH水平升高等［5L以上病理改變作為DOR造模成功的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。各種造模方法存在機(jī)制、用法、有效性、價(jià)格等差異，尚無(wú)統(tǒng)一的造模方法。以下分別對(duì)常用的幾種非自然衰老DOR小鼠造模方法進(jìn)行綜述?！[瘤化療藥物建立DOR小鼠模型.環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX):CTX是臨床上常用的化療藥物，可以使細(xì)胞DNA斷裂，抑制RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。CTX的生殖毒性主要針對(duì)卵巢組織，可以導(dǎo)致卵巢組織發(fā)生DOR特征性改變，甚至發(fā)生永久性損傷［6-8LCTX一般采用腹腔注射，常用劑量有以下幾種:①采用7~8周齡的雌性ICR小鼠CTX每日120mg/kg,連續(xù)腹腔注射14d后，小鼠血漿雌二醇降低到47%,AMH降低至1」52%［9L②李彩霞等［5］報(bào)道給予5~6周齡的雌性昆明小鼠一次性腹腔注射CTX120mg/kg，同時(shí)皮內(nèi)注射白消安(busulfan,BUS)12mg/kg一次。BUS是一種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物，長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致性功能減退、月經(jīng)不調(diào)等。注射后Id、5d、10d的卵巢仍有各個(gè)發(fā)育階段的卵泡存在，卵巢萎縮不明顯。注射后30d、60d卵巢萎縮明顯出現(xiàn)DOR特征性改變，并出現(xiàn)卵巢皮質(zhì)增厚，間質(zhì)纖維化、壞死，卵泡顆粒細(xì)胞層次減少、排列紊亂、細(xì)胞間隙增大?？梢奀TX與BUS聯(lián)合造模，DOR病理改變隨注射時(shí)間延長(zhǎng)而加重，卵巢纖維化損害可能不可逆。③Shen等［10］報(bào)道采用7~8周齡的雌性BALB/c小鼠，首劑腹腔注射CTX50mg/kg，然后連續(xù)14d每日注射8mg/kg，除了出現(xiàn)DOR特征性改變,還出現(xiàn)卵母細(xì)胞透明帶異常，卵巢黃體數(shù)量明顯減少、體積縮小、形狀不規(guī)則。造模成功后再予人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)0.2mL(lxlO6/mL)進(jìn)行尾靜脈注射，每周1次，4周后DOR損傷出現(xiàn)可逆性改變：小鼠動(dòng)情周期恢復(fù)正常、卵巢體積增大、雌二醇水平升高、FSH水平降低等。上述幾種劑量的CTX均成功造模，且卵巢損傷程度隨著CTX劑量增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而加重。通過(guò)調(diào)整CTX的劑量、作用時(shí)間，可以控制卵巢DOR損傷程度，以適用于不同的研究目的?？傊?，CTX具有經(jīng)濟(jì)、易于獲取、用法簡(jiǎn)單、造模周期短、效果確切、可重復(fù)性好、靶點(diǎn)明確、DOR損傷程度可控、損傷可逆的優(yōu)點(diǎn)，是最常用的造模藥物，尤其適用于dor治療性研究。.順鉗(cisplatin,CDDP):CDDP用于治療鼻咽癌、卵巢癌、膀胱癌、睪丸癌、淋巴癌等惡性腫瘤。CDDP的細(xì)胞毒性對(duì)生殖系統(tǒng)可造成損傷［111Wu等［12］報(bào)道對(duì)6周齡雌性C57BL/6J小鼠連續(xù)7d腹腔注射CDDP每日2.5mg/kg,以生理鹽水腹腔注射作為對(duì)照組。注射CDDP第3日小鼠發(fā)育卵泡明顯少于對(duì)照組，閉鎖卵泡明顯增多。連續(xù)注射7d后,卵泡損害加重，閉鎖卵泡更多，血漿雌二醇濃度明顯降低，F(xiàn)SH水平升高。林妍等［13］報(bào)道松果菊昔(echinacoside,ECH)能保護(hù)小鼠卵巢組織免受CDDP的損傷：ECH降低順鉗誘導(dǎo)的FSH水平升高，升高小鼠卵巢細(xì)胞線粒體酶活性。CDDP價(jià)格高、不易獲取，采用CDDP構(gòu)建小鼠DOR模型的報(bào)道較少，需要進(jìn)一步研究其適合劑量、造模效果、DOR損害是否可逆等。二.干預(yù)代謝類藥物建立小鼠DOR模型細(xì)胞內(nèi)半乳糖可被醛糖還原酶催化為半乳糖醇,細(xì)胞無(wú)法進(jìn)一步代謝半乳糖醇,造成半乳糖醇細(xì)胞內(nèi)積聚,破壞細(xì)胞正常滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。注射D-半乳糖會(huì)使小鼠卵巢細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇濃度增加，直接損害卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞［14LD-半乳糖導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,ROSX晚期糖基化終產(chǎn)物積累進(jìn)而導(dǎo)致DOR［15-161何連利［14］報(bào)道對(duì)6~8周齡雌性小鼠每日皮下注射D■半乳糖200mg/kg,6周后小鼠出現(xiàn)消瘦、活動(dòng)減少、精神萎靡、體毛晦暗無(wú)光澤、進(jìn)食及大小便減少，卵巢出現(xiàn)DOR特征性改變。周越等［17］報(bào)道D-半乳糖可以建立小鼠多囊卵巢綜合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)模型：采用20周齡ICR雌性小鼠每日腹腔注射D-半乳糖200mg/kg,8周后小鼠動(dòng)情周期紊亂、卵巢重量增加、單側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊性改變，血清睪酮、空腹血糖、空腹胰島素明顯升高。D-半乳糖構(gòu)建小鼠PCOS模型的機(jī)制尚不明確。因D-半孚喝建模效果文獻(xiàn)報(bào)道存在矛盾性，造模效果可重復(fù)性差，其是否適用于建立DOR模型有待進(jìn)一步研究。三.借助免疫損傷建立DOR模型.雷公藤多昔片(tripterygiumglycoside,TG):是主要用于治療自身免疫性疾病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中成藥，主要通過(guò)影響卵泡發(fā)育、抑制卵巢功能導(dǎo)致性腺毒性［18L長(zhǎng)期使用TG可引起月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)，甚至卵巢早衰［19L一項(xiàng)meta分析顯示雷公藤具有明顯的生殖毒性,且月經(jīng)紊亂發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)而升高［201磷脂酰三磷酸肌醇/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol3-kinase/proteinserinethreoninekinase,PI3K/AKT)信號(hào)通路在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用，TG可能通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙［21；Yuan等［22］采用8周齡雌性Blab/c小鼠每日進(jìn)行40mg/kgTG混懸液灌胃,14d后小鼠表現(xiàn)出活躍度降低、體毛松散晦暗無(wú)光澤、卵巢DOR特征性改變，子宮指數(shù)［子宮指數(shù)二子宮濕重(mg)/處死前小鼠體質(zhì)量(g)］也降低。采用TG進(jìn)行DOR小鼠造模的文獻(xiàn)報(bào)道較少，造模有效性、可重復(fù)性有待進(jìn)一步研究。.透明帶糖蛋白3肽(peptideofzonapellucida3,pZP3):pZP3可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗pZP3抗體(antibodytopeptideofzonapellucida3,AZP3Ab),與卵母細(xì)胞pZP3結(jié)合弓I起卵巢局部免疫紊亂，干擾卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的信息交換引起卵巢萎縮卵泡閉鎖＞卵母細(xì)胞損害和耗竭等DOR病理改變［23-24L田海清等［24］對(duì)6~8周齡雌性BALB/c小鼠皮下注射pZP375pg,2周注射1次。注射2周后血清雌二醇和FSH水平無(wú)明顯變化；4周后血清雌二醇水平明顯下降；6周后血清FSH水平明顯升高，雙側(cè)卵巢出現(xiàn)DOR特征性改變，各級(jí)生長(zhǎng)卵泡明顯減少，閉鎖卵泡增加，間質(zhì)嚴(yán)重纖維化。楊珍等［25］對(duì)pZP3造模成功的小鼠進(jìn)行中藥麟珠通煎煮液灌胃，6周后逆轉(zhuǎn)卵巢DOR病理改變：血清FSH和LH水平降低、AMH水平升高、卵泡數(shù)增加等。因此推測(cè)免疫制劑造成的小鼠DOR改變是可逆的適用于DOR治療性研究。但pZP3造模療程長(zhǎng)、價(jià)格貴、不易獲取，限制了其應(yīng)用。四.電離輻射方法建立DOR小鼠模型放射線可以損害細(xì)胞核，導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙；激活p53途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖，影響受照射器官的結(jié)構(gòu)和功能［26-28L有絲分裂期的細(xì)胞比DNA合成期的細(xì)胞對(duì)射線敏感性更高，卵母細(xì)胞大部分時(shí)間處于有絲分裂期,因此易受射線損傷。卵巢顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子等，放射線還可通過(guò)損害顆粒細(xì)胞，導(dǎo)致卵細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙，從而間接損害卵母細(xì)胞［5L李彩霞等［5］報(bào)道，對(duì)5~6周齡的雌性昆明小鼠進(jìn)行0.5Gy60co-y射線照射，照射率60cGy/min,照射野20cmx20cm,距離80cm,小鼠均出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、脫毛、體質(zhì)量下降。照射后第30日出現(xiàn)DOR特征性改變，且卵巢間質(zhì)嚴(yán)重纖維化，皮質(zhì)中僅存極少量卵泡，基質(zhì)細(xì)胞大量丟失。60co-y射線造模效果確切，但卵巢破壞嚴(yán)重，推測(cè)損害不可逆，不適用于DOR治療性研究。小鼠受到電離輻射損傷,出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),卵巢外其他組織器官亦出現(xiàn)不同程度的損壞［29］,且該方法對(duì)研究者存在射線損傷的風(fēng)險(xiǎn),不適合推廣使用。基因工程模型文獻(xiàn)報(bào)道敲除小鼠的Wdrl.Rps26、HFM1基因可以構(gòu)建DOR模型［30-32］，石志云等［30］報(bào)道敲除小鼠生殖細(xì)胞Wdrl基因出現(xiàn)卵巢體積縮小、卵泡數(shù)量減少。Liu等［31］報(bào)道敲除小鼠卵母細(xì)胞Rps26基因會(huì)導(dǎo)致卵泡停滯于竇前卵泡階段，不能發(fā)育至竇卵泡，Wang等［32］報(bào)道敲除小鼠卵母細(xì)胞HFM1基因可導(dǎo)致小鼠卵泡儲(chǔ)備減少及生育能力下降?；蚯贸夹g(shù)建模適用于研究與特定基因突變相關(guān)的DOR，以及基因突變導(dǎo)致DOR的分子機(jī)制，如干擾激素分泌、改變基因堿基序列從而改變編碼的氨基酸、影響染色體重組等［33L再進(jìn)一步針對(duì)導(dǎo)致DOR的分子機(jī)制，采用相應(yīng)的藥物治療,但目前尚未見基因工程建模后,再采用藥物治療DOR的相關(guān)報(bào)道因此該建模方法在DOR治療性研究中的作用有待探索?；蚯贸夹g(shù)難度高、價(jià)格昂貴、普及性差、小鼠飼養(yǎng)繁育要求高限制了其應(yīng)用范圍［34］;且基因突變?cè)贒OR發(fā)病中的確切機(jī)制不明確，某些DOR表型并未發(fā)現(xiàn)基因突變，因此其建模有效性有待進(jìn)一步研究。環(huán)境毒物損傷模型近年來(lái)DOR發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，可能與環(huán)境污染加劇有關(guān)［35L多環(huán)芳建(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)是在環(huán)境中持續(xù)存在的一種有機(jī)污染物，主要來(lái)源于火山噴發(fā)、造紙漂白程序、燃料不完全燃燒時(shí)產(chǎn)生的煙氣、有機(jī)氯制造等,廣泛存在于水、空氣或土壤中［361盛菲等［36］報(bào)道將育齡期小鼠卵巢置于PAHs培養(yǎng)液中，可導(dǎo)致卵泡數(shù)量減少、顆粒細(xì)胞凋亡。與DOR相關(guān)的環(huán)境