體外放射分析

競(jìng)爭(zhēng)放射分析

*放射免疫分析

*放射受體分析競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析

非競(jìng)爭(zhēng)放射分析

免疫放射分析酶放射分析放射酶促分析

*非標(biāo)記免疫分析技術(shù)放射免疫分析

（RadioimmunoassayRIA）

以標(biāo)記物與被測(cè)物及特異性結(jié)合試劑發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，從而對(duì)被測(cè)的極微量物質(zhì)作定量分析。RIA的特點(diǎn)：靈敏度高可達(dá)10-9

～１0-15g特異性強(qiáng)應(yīng)用范圍廣操作簡(jiǎn)便標(biāo)記抗原Ag*與特異性抗體Ab為有限量Ag增多，Ag*-Ab減少（競(jìng)爭(zhēng)性抑制)標(biāo)準(zhǔn)曲線：以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，測(cè)定標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)合率，以標(biāo)記抗原的濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)即為競(jìng)爭(zhēng)性抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)定未知樣品的結(jié)合率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可求出抗原的含量。

二、放射免疫分析的基本試劑要求標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)純度免疫活性含量標(biāo)定運(yùn)輸與保存特異結(jié)合試劑高親和力KＡ≥108/M高特異性其他高滴度標(biāo)記物高比活度SA〉370GBq/mmol（10Ci/mmol）

125I—2180Ci/mmol

3H—10Ci/mmol生物活性與免疫活性放射化學(xué)純度穩(wěn)定性三、放射免疫分析的分離方法分離方法的基本要求盡可能使結(jié)合與游離部分完全分開(kāi)分離效果穩(wěn)定，不受外界干擾非特異性結(jié)合盡可能小操作簡(jiǎn)便、分離迅速、適應(yīng)大量樣品分析、重復(fù)性好分離部分適應(yīng)自動(dòng)化測(cè)量和數(shù)據(jù)處理常用分離方法雙抗體法----免疫分離法非特異性沉淀法吸附分離法固相抗體法其他葡萄球菌A蛋白沉淀法、

RIA的基本步驟

加樣孵育分離結(jié)合和游離部分測(cè)放射性cpm數(shù)據(jù)處理加樣法典型加樣法:

抗體、抗原及標(biāo)準(zhǔn)抗原或樣品同時(shí)加樣.順序加樣法:

先加抗體和非標(biāo)記抗原或樣品，孵育一定時(shí)間后再加入標(biāo)記抗原。孵育不同分析對(duì)象,反應(yīng)達(dá)到平衡所需孵育時(shí)間和溫度不同有的隨溫度降低而親和力(KA)提高，分析靈敏度也提高，有的則溫度對(duì)KA的影響不大。溫度降低將使達(dá)到平衡的時(shí)間延長(zhǎng)，所以選用什么孵育溫度應(yīng)衡量所需的靈敏度及臨床需要檢驗(yàn)報(bào)告的緩急來(lái)選定。時(shí)間到達(dá)后轉(zhuǎn)入冰浴等待分離。分離結(jié)合和游離部分選擇適當(dāng)?shù)囊环N分離方法，將結(jié)合和游離部分分開(kāi)。測(cè)放射性125I-抗原，通常都可直接用NaI閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量cpm值，３H-抗原，往往需要將樣品轉(zhuǎn)化為均相。由于各樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量效率相同，RIA通常都不必?fù)Q算成dpm。數(shù)據(jù)處理

將實(shí)測(cè)結(jié)果(放射性單位)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算成標(biāo)本中待測(cè)物的量。

由于系統(tǒng)中有生物制劑，可變因素多，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)和待測(cè)樣品同時(shí)測(cè)定。

測(cè)量到的結(jié)果最后需換算成待測(cè)物的量或濃度，現(xiàn)已有各種計(jì)算機(jī)軟件供選用。應(yīng)當(dāng)盡可能選用較先進(jìn)的軟件，使換算結(jié)果更為可靠，RIA的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考量

對(duì)于已經(jīng)選定抗體和標(biāo)記抗原的系統(tǒng):考慮合適的體積、緩沖液、孵育時(shí)間、分離方法、樣品預(yù)處理方法

考慮如何選定抗體和抗原的用量，使標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)多數(shù)待測(cè)樣品得到滿意的精密度。如果多數(shù)樣品含量都很低，則是如何提高零劑量的精密度亦即靈敏度。四、放射免疫分析的質(zhì)量控制

質(zhì)控目的：對(duì)分析誤差進(jìn)行經(jīng)常性的檢查誤差及分類(lèi)系統(tǒng)誤差（單向性，規(guī)律性）隨機(jī)誤差（雙向性、統(tǒng)計(jì)性質(zhì)）過(guò)失誤差（嚴(yán)重失真、無(wú)規(guī)律性）誤差來(lái)源試劑（標(biāo)準(zhǔn)品變性、標(biāo)記抗原脫標(biāo)、抗體變性、分離試劑失效等）樣品（采集、制備、貯存不當(dāng)）操作分析器具與設(shè)備放射性測(cè)量質(zhì)控內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)控

標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量檢查各未知樣品分析結(jié)果的可靠性檢查整批實(shí)驗(yàn)的精密度檢驗(yàn)批內(nèi)漂移的檢驗(yàn)整批實(shí)驗(yàn)偏差檢驗(yàn)長(zhǎng)期漂移的檢驗(yàn)（批間質(zhì)控）質(zhì)控指標(biāo)靈敏度（sensitivity)精密度（precision)準(zhǔn)確度（accuracy)特異性（specificity)穩(wěn)定性（stability)臨床有效性（clinicaleffectiveness)靈敏度（sensitivity)

在確定的可信限內(nèi)，測(cè)定方法的最小可測(cè)量。其定義是能與零劑量（B0）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別的最小劑量.方法1“0”劑量點(diǎn)結(jié)合率的均值減去其二倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的劑量值.方法2“0”劑量點(diǎn)結(jié)合率降低10%后的結(jié)合率對(duì)應(yīng)的劑量值為最小可測(cè)劑量,如反應(yīng)參數(shù)采用B/B0，則應(yīng)以B/B0=90%時(shí)對(duì)應(yīng)的劑量為最小可測(cè)量測(cè)定10個(gè)或10個(gè)以上的“零”標(biāo)準(zhǔn)管，求出各管的結(jié)合率（B/T%）和10個(gè)管結(jié)合率的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，用均數(shù)減去兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，求其相對(duì)應(yīng)的濃度，即為最小檢出值。精密度（precision)

是指同一樣品重復(fù)測(cè)定的實(shí)測(cè)量的離散程度。離散程度越小，則能區(qū)別的樣品量差別越小，也就是分析系統(tǒng)的精密度越高.通常以復(fù)管的變異系數(shù)(CV)表示。

CV=SD/均數(shù)×100(%)

CV%≤10%準(zhǔn)確度（accuracy)

準(zhǔn)確度是指樣品的測(cè)定值偏離真值的程度(偏倚Bias)，

由于實(shí)際樣品的真值是未知的，常用的估計(jì)準(zhǔn)確度的方法是測(cè)定實(shí)際樣品外加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率。

回收率計(jì)算如：一樣品測(cè)得其ＡＦＰ的含量為４５ng/ml,加入５ng的標(biāo)準(zhǔn)ＡＦＰ，測(cè)得含量為50.25ng/ml.計(jì)算其回收率．回收率＝(50.25-45)/5×100%=105%要求：９０％～１１０％質(zhì)控樣品(QCpools)已知含量的樣品，專(zhuān)門(mén)為質(zhì)控而制作，預(yù)先分裝，妥善保存，可供多次使用。每批實(shí)驗(yàn)選高、中、低含量的三個(gè)樣品，與未知樣品同樣處理，測(cè)定結(jié)束后計(jì)算每種含量QC樣品的實(shí)測(cè)含量及其均值。如果沒(méi)有明顯偏差，則應(yīng)和期望值相近，在期望值均值2SD的范圍內(nèi)。如果QC樣品測(cè)定值都向同一側(cè)超出均值2SD的范圍，則強(qiáng)烈提示本批實(shí)驗(yàn)有系統(tǒng)偏差，應(yīng)當(dāng)舍棄后重做。特異性（specificity)

交叉反應(yīng)的檢測(cè)干擾物質(zhì)抑制結(jié)合率50%所需濃度與待測(cè)物本身抑制50%所需濃度之比即為衡量交叉反應(yīng)的參數(shù)

對(duì)cGMP的RIA,ATP無(wú)抑制作用，即交叉反應(yīng)極小，cAMP抑制結(jié)合率50%所需濃度為cGMP的100倍，通常就說(shuō)cAMP對(duì)該cGMP抗體的交叉反應(yīng)為1:100.可疑數(shù)據(jù)“去消”檢驗(yàn)

如檢測(cè)大鼠心肌β腎上腺素受體（正常對(duì)照）10例其數(shù)據(jù)為：

29.4034.2227.4732.0532.7335.1727.1722.13*30.1034.10

t=2.05（t〈2.18p〉0.05）

免疫放射分析法

Immunoradiometricassay,IRMA1968:Miles&Hales原理

過(guò)量標(biāo)記抗體與非標(biāo)記抗原形成復(fù)合物，用免疫吸附劑(ImAd)除去多余的游離抗體，復(fù)合物的放射性與非標(biāo)記抗原的量呈正相關(guān)。免疫放射分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸法五參數(shù)logistic法一、IRMA的主要特點(diǎn)屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物的量與所加非標(biāo)記抗原的量呈正相關(guān)在低劑量區(qū)不會(huì)有不確定因素，RIA則劑量低到一定程度就會(huì)有不確定因素出現(xiàn)，影響靈敏度IRMA的非特異結(jié)合對(duì)低劑量區(qū)影響大，因此對(duì)分離條件的要求特別嚴(yán)格。IRMA和RIA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖.

當(dāng)待測(cè)物分子數(shù)少到一定量，RIA可能出現(xiàn)1或0兩種情況，

也就是和零劑量無(wú)法分開(kāi)，IRMA則沒(méi)有這種情況二、免疫放射分析的基本方法

雙抗體夾心法

標(biāo)記第三抗體法生物素親合素系統(tǒng)

(biotinavidinsystem，BAS)雙抗體夾心法ImAd-Ab1(過(guò)量)+AgImAd-Ab-Ag+*Ab2

ImAd-Ab1-Ag-*Ab2

雙抗體夾心法IRMA示意圖雙抗體夾心法（1）固相抗體先與抗原結(jié)合，再與標(biāo)記抗體結(jié)合。

(過(guò)剩)（2）抗原先與標(biāo)記抗體結(jié)合，再與固相抗體結(jié)合。（3）抗原與固相抗體和標(biāo)記抗體同時(shí)反應(yīng)標(biāo)記第三抗體法ImAd-Ab1+Ag+Ab2ImAd-Ab1-Ag-Ab2+*Ab3ImAd-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3

標(biāo)記第三抗體法IRMA示意圖標(biāo)記第三抗體法

抗原先與兩種亞型的單克隆抗體結(jié)合，再與過(guò)量的標(biāo)記第三抗體結(jié)合。

生物素125I親合素標(biāo)記的IRMA示意圖1.被測(cè)抗原性質(zhì)抗原分子有兩個(gè)以上的抗原決定簇2.結(jié)合在固相抗體上的抗原穩(wěn)定性

在反應(yīng)中,抗原有從固相抗體上分離的傾向,抗原濃度高時(shí)尤甚,故高濃度區(qū)的準(zhǔn)確性較差.三、影響免疫放射分析方法的主要因素3.反應(yīng)時(shí)間和溫度

提高溫度可縮短反應(yīng)時(shí)間,但劑量反應(yīng)曲線也會(huì)受到不同程度的抑制4.標(biāo)記抗體濃度

增加標(biāo)記抗體可縮短反應(yīng)時(shí)間,擴(kuò)大測(cè)量范圍,但非特異性結(jié)合也隨之增加從而使靈敏度會(huì)下降.5.固相物的洗滌

第一次洗滌第二次洗滌6.血清、電解質(zhì)和其它溶質(zhì)的非特異性效應(yīng)血清效應(yīng):指血清中的有關(guān)成份(如IgM或α2微球蛋白能非特異性抑制抗原抗體特異性結(jié)合的效應(yīng).反應(yīng)溫度越高,血清效應(yīng)越明顯.IRMA的主要缺點(diǎn)：一個(gè)實(shí)用的IRMA系統(tǒng)必需至少有兩株抗體，因此，IRMA的應(yīng)用目前還主要限于肽類(lèi)和蛋白質(zhì)，很多小分子半抗原不能應(yīng)用。IRMA反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)緩沖液pH及離子強(qiáng)度的要求較嚴(yán)格，應(yīng)當(dāng)更嚴(yán)格地加以控制.在某些系統(tǒng)中可能出現(xiàn)“倒鉤”現(xiàn)象，也就是待測(cè)抗原的量很高時(shí)，復(fù)合物反而降低.IRMA倒鉤效應(yīng)倒鉤效應(yīng):抗原劑量增加大一定程度時(shí),再增加抗原,測(cè)定的復(fù)合物放射性濃度反而下降.五.IRMA與RIA的異同點(diǎn)1．標(biāo)記物

在RIA中核素標(biāo)記抗原，在IRMA中核素標(biāo)記抗體。

抗原有不同種類(lèi)，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時(shí)需用不同的核素和不同的方法?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)記，不同抗體標(biāo)記方法基本相同。標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。2．反應(yīng)速率

反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比.在IRMA中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，而且不存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合復(fù)雜的反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較RIA快。RIA中抗體量是微量的，使用高親和力的多克隆抗體.在IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體3．反應(yīng)模式

RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線為正相關(guān)的關(guān)系。4．特異性

IRMA一般均應(yīng)用針對(duì)不同位點(diǎn)的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。5．標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作濃度:RIA的工作范圍為2～3個(gè)數(shù)量級(jí)

RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。線性回歸法五參數(shù)logistic法6．分析誤差

RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果。IRMA中標(biāo)記和固相抗體在反應(yīng)中都是過(guò)量的，只有受檢標(biāo)本的加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果。因此，IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。7．其它

RIA可以測(cè)定大分子量與小分子量的物質(zhì)，雙位點(diǎn)IRMA只能測(cè)定在分子上具有2個(gè)以上抗原表位的物質(zhì)