受體藥物篩選設(shè)計(jì)第一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience受體藥物篩選與設(shè)計(jì)

上世紀(jì)60年代前受體的研究都用整體動(dòng)物，定性的研究，這樣的研究效率低，藥物用量大，整個(gè)研究工作速度很慢。上世紀(jì)60年代后受體的研究采用放射配基結(jié)合分析，受體研究進(jìn)入分子和定量時(shí)代，研究效率高，藥物用量小,而且開(kāi)展受體亞型的研究，大大加快了受體新藥發(fā)展，因此，受體藥物研究已從盲目的隨機(jī)篩選進(jìn)入根據(jù)一個(gè)已知受體樣本為基礎(chǔ)篩選毒副作用更小的新藥開(kāi)發(fā),是受體藥物進(jìn)入大發(fā)展時(shí)期。1996年有人統(tǒng)計(jì)了以生化類分子為靶點(diǎn)的現(xiàn)代治療藥483種受體藥物約占63%,見(jiàn)下表：第二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscienceBiochemicalClassesofDrugTargetsofCurrenttherapies

-------------------------------------------------------------------------------------------------Moleculartargetsofdrugtherapy-------------------------------------------------------------------------------------------------

TargetNumberofdrugs(n=483)%

GPCRs21745Enzymes13528Hormonesandfactors5311Unknown347Ionchannels245Nuclearreceptors102DNA102-----------------------------------------------------------------------------------------------第三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience笫一節(jié)受體藥物的篩選一、受體藥物體外篩選的放射配基結(jié)合分析系統(tǒng)

1.準(zhǔn)備受體膜或細(xì)胞株或細(xì)胞核標(biāo)本，2.放射性標(biāo)記配體。3.要確定結(jié)合反應(yīng)的平衡條件。包括溫度、時(shí)間、緩沖液（離子強(qiáng)度及pH）等。調(diào)節(jié)這些因素可以獲得最佳溫育條件，以確保溫育達(dá)到平衡

拮抗劑的濃度

二、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)和飽和結(jié)合反應(yīng):1.競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng):競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)是一定量受體蛋白加一定量的放射配基.再加不同濃度的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合物,可繪出競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線,可獲得IC50值。第四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience2.飽和結(jié)合反應(yīng):飽和結(jié)合反應(yīng)是一定量受體蛋白加遞增的配基濃度，直到飽和結(jié)合狀態(tài)。可繪出飽和結(jié)合曲線，并且通過(guò)Scatchard直線轉(zhuǎn)換,可獲得重要參數(shù)Bmax(RT)及Kd。拮拮抗劑的濃度競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，飽和結(jié)合反應(yīng)，這兩種結(jié)合反應(yīng)加樣方式是不同的.飽和曲線圖

第五頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscienceIC50值與Ki值：表明抑制劑與受體結(jié)合作用強(qiáng)弱的指標(biāo)

IC50值僅有相對(duì)意義，因?yàn)榉派湫员然疃炔煌荏w用量不同,IC50值會(huì)不一樣,常不能與其它實(shí)驗(yàn)室值相比較，它并不能反應(yīng)外界抑制劑與內(nèi)源性配基與受體的競(jìng)爭(zhēng)是什么性質(zhì)。

Ki值:抑制常數(shù),它實(shí)際上是外界抑制劑與受體的平衡解離常數(shù)，不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，是個(gè)常數(shù)，不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以比較。所以是外界抑制劑最好的指標(biāo),另外，它還能反映外界抑制劑與內(nèi)源性配基對(duì)受體競(jìng)爭(zhēng)是什么性質(zhì)，是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或反競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合等。

Ki值求解：1.雙倒數(shù)作圖法。求解時(shí),加樣方式如同飽和結(jié)合反應(yīng)(I0),同時(shí)再做飽和結(jié)合管數(shù)(除總放射配基,B0,NSB外)其它各管加一定量抑制劑(I1)，可以求兩條雙倒曲線，兩條曲線相交縱軸即競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合曲線，按(5-24式)求Ki值，按(5-25式)求Ki值，第六頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合曲線非競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合曲線第七頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience2.利用(5-27式)求解。用此公式有兩點(diǎn)需強(qiáng)調(diào)：A.是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。B.在反應(yīng)平衡時(shí).配基濃度[L]是游離配基濃度，所以[L]是不易取得，如果總結(jié)合[RT]遠(yuǎn)小于[LT],所以[LT]與[L]是非常接近，可以用[LT]代[L]。IC50與Ki關(guān)系式(5-27)如下:第八頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience對(duì)于篩選工作，IC50值,使用非常廣泛，有實(shí)際意義。如果對(duì)某些老藥改進(jìn)，選譯副作用更小的新藥，常用所謂相對(duì)結(jié)合親和力（Relativebindingaffinity)數(shù)：以相對(duì)結(jié)合親和力來(lái)比較眾多待試化合物與以老藥為標(biāo)準(zhǔn)作參比。第九頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience三.受體藥物體外篩選2、高通量和自動(dòng)化篩選法:這一方法的目標(biāo)是短時(shí)間內(nèi)篩選大量化合物，高通量篩選應(yīng)包括:(1).存有大量天然物提取物的樣品庫(kù)，(2).存有大量的化合物庫(kù),大量的合成化合物，現(xiàn)在有所謂的組合化學(xué)技術(shù)，此法起源于多肽合成，假如合成四肽，用5種氨基酸，可合成625種四肽，用10種氨基酸可合成10000種四肽。但是,不是什么化合物都可用組合化學(xué)技術(shù),傳統(tǒng)化學(xué)合成方法仍是主要的手段。(3).特異性強(qiáng)，選擇性好的受體反應(yīng)系統(tǒng)。(4).自動(dòng)化稱量和加樣系統(tǒng)。(5).自動(dòng)化數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。1、手工篩選法：操作過(guò)程包括采集,制備受體制劑,進(jìn)行受體結(jié)合反應(yīng).一次實(shí)驗(yàn)只能做幾個(gè)樣品。對(duì)少數(shù)含有生物活性的化合物作進(jìn)一步篩選,最后確定有希望成為所謂先導(dǎo)化合物。這種方式也可用來(lái)篩選副作用小的受體藥物.第十頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience3、高通量篩選分析方法和技術(shù):(1)放射配基結(jié)合分析(2)閃爍近鄰分析(scintilationproximityassay)(3)時(shí)間分辨熒光(timeresolvedfluorescence)(4)熒光相關(guān)光譜學(xué)等(5)酶聯(lián)免疫吸附法第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience閃爍近鄰分析(scintilationproximityassay：SPA)1.原理：含有閃爍劑的微球或96孔板，用化學(xué)方法將受體蛋白偶聯(lián)在它們的表面，試驗(yàn)時(shí)加含有3H或125I等放射性標(biāo)記配基的反應(yīng)緩沖液，待反應(yīng)平衡后,所形成的受體配基復(fù)合物緊貼微球表面,射線作用于閃爍劑，放射性測(cè)量?jī)x器就能測(cè)量到放射性計(jì)數(shù)。而游離的放射性配基與微球表面的距離只要3H大于1.0μm或125I大于1.5及17.5μm,射線的能量被水吸收，射線作用不到閃爍劑，儀器就不能測(cè)到計(jì)數(shù)，所以APS法的優(yōu)點(diǎn)是不需要分離，這是平衡常數(shù)Kd最理想的測(cè)量方法。這種方法操作簡(jiǎn)便，適用于高通量篩選法。2.組成：如下圖所示第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience一、受體藥物研究的趨勢(shì)與方向：笫二節(jié)受體藥物的分子設(shè)計(jì)受體藥物研究的靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞膜上的GPCRs,單跨膜有酶和無(wú)酶的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子受體，配基門(mén)控離子通道以及胞內(nèi)核受體。從前數(shù)據(jù)可知當(dāng)前生化類分子為靶的治療藥中受體藥物占有63%之多，據(jù)調(diào)查,人類35000個(gè)基因中大約有750個(gè)基因是屬于GPCRs，其中有幾乎一半屬于感覺(jué)受體，剩下約有400個(gè)左右可以考慮作為藥物的靶點(diǎn)，其中30個(gè)藥物已經(jīng)上市，160個(gè)被稱之孤兒受體功能不明，所以還有210個(gè)GPCRs有自然配基，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)新藥，據(jù)說(shuō)目前在新藥開(kāi)發(fā)中有60至70%力的集中在GPCRs受體之中。第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience二、新藥開(kāi)發(fā)的途徑：

1.改進(jìn)老藥：現(xiàn)有的上市藥物中有60%有待改進(jìn)，使其具有更好藥效。有些老藥對(duì)某些疾病雖有治療效果,但其副作用明顯,為改善其副作用,加強(qiáng)特異性,如已經(jīng)知道某些受體有了一些亞型,各亞型生物活性是不同的,其副作用,可能就產(chǎn)生于某一亞型,所以根據(jù)亞型尋找選擇性更好的藥物。改造后的老藥其專一性更突出，副作用更輕或者副作用消失。2.先導(dǎo)化合物開(kāi)路：在篩選工作中得到IC50在100nmol/L左右的化合物可以做所謂的先導(dǎo)化合物，先導(dǎo)化合物常常是新藥最早的先驅(qū)者,在些基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)，希望得到IC50值更小的化合物將其開(kāi)發(fā)成新藥。3.加強(qiáng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究，闡明疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)，是我們基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究根本目標(biāo)和責(zé)任，也是新藥開(kāi)發(fā)的的源泉。第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience三、新藥設(shè)計(jì)的方法：

1.二維的定量的構(gòu)效關(guān)系方法:上世紀(jì)80年代前，計(jì)算機(jī)輔助配基或藥物設(shè)計(jì)，常用疏水常數(shù)，電性常數(shù)，摩爾折射等分子或基團(tuán)的理化參數(shù)耒描寫(xiě)化合物的結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系，實(shí)際上都是基于化合物的二維結(jié)構(gòu)的資料，這可稱為二維定量構(gòu)效關(guān)系(2D-quntitativestructureactivityrelationship:2D-QSAR)。2.三維定量構(gòu)效關(guān)系方法：上世紀(jì)80年代后隨著現(xiàn)代生物學(xué)，量子化學(xué)和大容量計(jì)算機(jī)發(fā)展和應(yīng)用，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)進(jìn)入三維定量構(gòu)效關(guān)系研究，藥物與受體的相互作用需要在三維空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，特別在GPCRs的雙層脂存在疏水的三維結(jié)合空腔，因此，為準(zhǔn)確表達(dá)藥物與受體的相互作用，必需進(jìn)行三維構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR)的研究，建立更合理的設(shè)計(jì)模型。根據(jù)受體的三維結(jié)構(gòu)是否已知，可分為直接設(shè)計(jì)和間接設(shè)計(jì)藥物分子。第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience(1).直接設(shè)計(jì):當(dāng)受體三維結(jié)構(gòu)已知，可以將侯選的配基導(dǎo)入結(jié)合區(qū)，進(jìn)行量體裁衣，直接進(jìn)行藥物分子的設(shè)計(jì),此法也稱基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。但,此法須知藥物與受體分子最佳結(jié)合時(shí)構(gòu)象的變化及構(gòu)象的能量值，結(jié)合方式及溶劑效應(yīng)等參數(shù)。一般而言，這些參數(shù)是不容易得知。解決此難題的一個(gè)有效的方法是反復(fù)研究藥物-受體匹配，化合物合成，生物學(xué)評(píng)價(jià)及配基受體復(fù)合物作X-晶體分析，能取得藥物分子的成功設(shè)計(jì)。

(2).間接設(shè)計(jì)：藥物的直接設(shè)計(jì)必須了解受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在大多數(shù)的GPCRs的三維結(jié)構(gòu)還末搞清。在這種情況下直接藥物設(shè)計(jì)就困難了。所以只能改用間接設(shè)計(jì)方法,間接設(shè)計(jì)是通過(guò)計(jì)算分析，對(duì)一系列相同靶點(diǎn)，相同作用機(jī)制的化合物進(jìn)行比較,找出共同的三維構(gòu)效功能基團(tuán)的構(gòu)象，推導(dǎo)模擬先導(dǎo)化合物，進(jìn)行藥物分子設(shè)計(jì)。間接設(shè)計(jì)的基本假設(shè)是受體—配基相互作用時(shí)兩者在空間和電性方面是互補(bǔ)的，

三維藥效基團(tuán)作為藥物分子中關(guān)鍵部分和受體蛋白分子發(fā)生鍵合作用時(shí)原子或功能基之間的三維空間的關(guān)系必須匹配，另外還必須了解受體跨膜區(qū)結(jié)合空腔的三維信息，一個(gè)高親和性的藥物結(jié)構(gòu)應(yīng)與受體結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象必須相適應(yīng)。建立一個(gè)合理的三維藥效功能基團(tuán)的模型不僅為設(shè)計(jì)新藥物奠定基礎(chǔ)，也可以為優(yōu)化先導(dǎo)化合物創(chuàng)造條件。直接設(shè)計(jì)和間接設(shè)計(jì)藥物分子：第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience四、受體藥物設(shè)計(jì)應(yīng)用的例子說(shuō)明:

血管緊張素II(AII)主要是通過(guò)激活特異性受體(AT)而發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、水鹽攝入、尿鈉排泄等生物活性,現(xiàn)已知道AT至少有AT1和AT2兩種亞型,ATl受體介導(dǎo)幾乎所有AII所產(chǎn)生的生物效應(yīng)。多年來(lái)人們致力于尋找有效的AT1拮抗劑。特別是如何由隨機(jī)藥物篩選過(guò)渡到基于藥物作用分子機(jī)制的基礎(chǔ)上通過(guò)主動(dòng)的藥物設(shè)計(jì)來(lái)發(fā)現(xiàn)有效的AT1受體拮抗劑。已上市的藥物洛沙坦(Losartan)是個(gè)成功的例子，說(shuō)明如下:

1.AT1受體的結(jié)構(gòu):AT1受體由359個(gè)氨基酸殘基組成，是個(gè)典型的G-蛋白耦聯(lián)的七次跨膜受體,它的三維結(jié)構(gòu)如下:第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience2.存在于AT1受體跨膜區(qū)內(nèi)α-螺旋之間的相互作用第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience

3.AT1受體和AII的相互結(jié)合:AII是個(gè)八肽:Asp-arg-val-tyr-LIe-His-pro-phe經(jīng)基因突變和親和結(jié)合試驗(yàn)及核磁共振研究認(rèn)為AII八肽呈扭曲形插入受體跨膜區(qū)結(jié)合空腔內(nèi)，見(jiàn)下圖：認(rèn)為AII與AT1受體的結(jié)合位點(diǎn):

AII中的Asp1、Arg2

與AT1受體膜外的His183、Asp281相結(jié)合,AII中的Tyr4、His6、Phe8插入受體的跨膜區(qū),分別與Asn111、Asp263

、Lys199、Trp253、

His256相結(jié)合。第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofBasicMedicalscience4.由隨機(jī)藥物篩選到藥物分子設(shè)計(jì):第一個(gè)AT1受體非肽拮抗劑是從許多化學(xué)合成物中利用放射配基結(jié)合分析篩選中發(fā)現(xiàn)的：如圖12-3中(6)5-醛基咪唑,從此進(jìn)入藥物設(shè)計(jì)工作。第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，編輯于2023年，星期二Dept.ofBiophysics,PekingUniversitySchoolofB