Western-blot實(shí)驗(yàn)原理WesternBlot法采用聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行著色。被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，”顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)。根據(jù)著色的位置和著色深度以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。從而獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。實(shí)驗(yàn)步驟.提取蛋白細(xì)胞總蛋白的提取棄去培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加入PBS2ml洗滌2次，加入60-120ulRIPA裂解液（具體加的量按照細(xì)胞生長密度的實(shí)際情況調(diào)整），用細(xì)胞刮刀沿同一方向刮取細(xì)胞（冰上操作），收集到2ml的EP管內(nèi)（EP管放于冰盒中預(yù)冷）。在搖床上振搖15min.4℃10000rp條件下離心10min,吸取總蛋白上清液，到另一個(gè)EP管中（EP管放于冰盒中預(yù)冷）蛋白質(zhì)定量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取一塊96孔板，按照下表加入試劑：表1蛋白質(zhì)定量試劑量孔號(hào)01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（uL）01248121620去離子水（uL）2019181612840對(duì)應(yīng)蛋白含量（ug）00.51.02.04.06.08.010.01.2.2根據(jù)蛋白樣品數(shù)量，按BCA試劑A與試劑B（50：1）配制適量BCA工作液，充分混勻。各孔加入200uLBCA工作液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照（200ul的工作液+19ul去離子水），每組一般設(shè)三個(gè)復(fù)孔。把96孔板放在搖床上振搖30min,37°C放置30min,然后在562nm下比色測定。以蛋白含量（ug）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20ul（一般加1ul的蛋白樣品，19ul的蒸餾水），加入BCA工作液200ul,充分混勻，37℃放置30min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)管做參比，在562nm波長下比色，測定吸光度。根據(jù)所測樣品的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（ug），除以樣品稀釋液總體積（20ul），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度（單位：ug/ul）蛋白質(zhì)變性加入5*SDS上樣緩沖液（體積為總蛋白上清液的1/4,例如：100ul的蛋白上清液，所要吸取的5*SDS上樣緩沖液的體積為25ul）。渦旋后，沸水煮5min即可，冷卻后放入-20℃待用。注意事項(xiàng)RIPA裂解液需要提前從冰箱拿出，完全融化為液體后方可使用（可用冷水水浴解凍）。用預(yù)冷的PBS洗滌后，需將PBS用移液槍吸取干凈4℃10000rp離心10min時(shí)需要準(zhǔn)確配平（配平方法：取與樣品相同的EP管，稱取與蛋白樣品質(zhì)量一樣的水），將等質(zhì)量的離心管以轉(zhuǎn)軸為中心對(duì)稱放好，EP管的開口向下。注意檢查所用EP管的完整性。2.制膠和電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

6%8%10%12%15%5%蒸餾水（娃哈哈）7.95ml6.9ml6ml4.95ml3.45ml4.2ml30%Acr/Bic丙烯酰胺3ml4.05ml4.95ml6ml7.5ml1.245ml1.5MTrisHCL(pH=8.8)3.75ml3,75ml3.75ml3.75ml3.75ml/1MTrisHCL(pH=6.8)/////1.89ml10%SDS150ul150ul150ul150ul150ul75ul10%APS150ul150ul150ul150ul150ul75ulTEMED12ul9ul9ul6ul6ul7.5ul表3聚丙烯酰胺凝膠配方（兩塊板）分離膠濃縮膠備注:（1） 1.5MTrisHCL（pH=8.8）稱取Tris18.172g,超純水定容至95ml,濃鹽酸調(diào)pH值（調(diào)節(jié)pH值的方法參考說明書）（2）1MTrisHCL（pH=6.8）稱取Tris6.056g,超純水定容至95ml,濃鹽酸調(diào)pH值（調(diào)節(jié)pH值的方法參考說明書）（3）10%SDS十二烷基硫酸鈉稱取SDS10g,超純水定容至100ml,室溫保存，如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，可繼續(xù)使用。（4） 10%APSAPS0.1g,超純水1ml，過硫酸銨在溶液中會(huì)慢慢衰變，故貯存液只能存放1周，4℃保存。不同濃度分離膠的最佳分離范圍表3不同濃度分離膠的最佳分離范圍SDS分離膠濃度最佳分離范圍（樣品蛋白的分子量）6%膠50-150KD8%膠30-90KD10%膠20-80KD12%膠12-60KD15%膠10-40KD備注：蛋白樣品的分子量不同，所制備的分離膠的濃度不同，應(yīng)根據(jù)具體情況制備不同的分離膠。實(shí)驗(yàn)步驟取大小玻璃板，下邊對(duì)齊，放在夾子中夾緊。加入超純水（娃哈哈）檢漏，倒去超純水，用濾紙將水盡量吸干。灌制分離膠根據(jù)所需濃度，按表中比例，取各種試劑，搖動(dòng)混勻后加入10%APS和TEMED（加入后立即混勻，開始灌膠，因?yàn)檫@兩種試劑為促凝劑），輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，將分離膠溶液平穩(wěn)地注入兩層玻璃板中（以平穩(wěn)流速從玻璃板的中間位置注入，緩慢持續(xù)注入至紅色刻度線下3-5mm），再在液面上緩慢小心注入一層蒸餾水（用膠頭滴管抵住大玻璃板緩慢滴加蒸餾水，因?yàn)榈渭诱麴s水過快，會(huì)沖擊分離膠的膠面，導(dǎo)致膠面不平），以隔絕空氣，靜置45min至分離膠形成。制備濃縮膠（配方見上表）待分離膠完全聚合后（膠面與上面的水相有明顯的界面，約45分鐘），傾出覆蓋層液體，用濾紙吸凈上層液體?；靹驖饪s膠，以連續(xù)平穩(wěn)的流速在分離膠上面注入濃縮膠至兩個(gè)玻璃板間（如果加完濃縮膠后，液面上有氣泡，插梳子前，用梳子刮一下濃縮膠的液面，將液面上的氣泡趕走后，再插梳子），然后立即插入梳子。注意:插梳子時(shí)要防止膠濺到自己!!！待濃縮膠完全聚合后（15min），輕輕取下夾子，注意不要改變玻璃板的相對(duì)位置。將凝膠板安置于電泳槽，在電泳槽上下即兩側(cè)電極槽中注入電泳緩沖液內(nèi)槽加新鮮蛋白電泳液，外槽加新鮮（或回收的）蛋白電泳液。力口樣豎直向上緩慢的拔出梳子（如果加樣孔出現(xiàn)彎曲，用進(jìn)樣器將加樣孔撥直。如果內(nèi)槽的電泳液液面有所下降，補(bǔ)加新鮮的電泳液，一旦上樣，則不能再加電泳液）。用微量進(jìn)樣器吸樣，進(jìn)樣器的剖面緊貼小玻璃板加樣，加樣時(shí)，maker與蛋白之間空一個(gè)孔，以避免蛋白影響maker指示。每次加不同的樣品后吸蒸餾水清洗進(jìn)樣器。加樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，以減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散。上樣時(shí)，小心不要使樣品溢出而污染相鄰加樣孔。電泳先80V電壓預(yù)電泳30min（電泳的時(shí)間隨溫度、加樣量等有所變化，應(yīng)根據(jù)具體的情況選擇電泳的時(shí)間），當(dāng)marker前沿進(jìn)入分離膠（即分離膠上出現(xiàn)marker的條帶），提高電壓（120V）觀察蛋白接近膠底時(shí)（約1h），停止電泳，關(guān)閉電源。表4電泳液的配方甘氨酸18.77gTris3.0gSDS1.0g超純水定容至114口保存，可重復(fù)利用3次.轉(zhuǎn)膜切膠從電泳裝置上卸下玻璃板，用小紅板從玻璃板的中間輕輕撬開玻璃板。依據(jù)marker的指示找到目標(biāo)蛋白所在的地方，切下膠帶（稍微切的寬一點(diǎn)，以保證所切條帶中含有目標(biāo)蛋白）。根據(jù)所切膠帶的寬度，剪一條能夠完全覆蓋膠帶的PVDF膜（注意：PVDF膜在整個(gè)轉(zhuǎn)膜的過程中要保持濕潤，否則可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜失?。。。。?，并用甲醇潤濕5min,再剪一條比PVDF膜稍窄的薄濾紙，轉(zhuǎn)膜液潤濕。在盤子里倒入一定量的轉(zhuǎn)膜液，放上夾子，黑色面水平。在黑色面上依次放上一塊海綿，一張薄濾紙，切好的膠帶，PVDF膜，潤濕的薄濾紙，厚濾紙，海綿。保持整個(gè)裝置內(nèi)濕潤和沒有氣泡。接通電源，開始轉(zhuǎn)膜夾子夾好后，放入轉(zhuǎn)膜槽中，注意黑色的面與轉(zhuǎn)膜槽中的黑色架子同方向。倒入轉(zhuǎn)膜液至與側(cè)面小孔處齊平，在冰浴中，恒流條件下以200mA轉(zhuǎn)膜60min（根據(jù)蛋白的分子量不同，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）。表5轉(zhuǎn)膜液配方甘氨酸2.93gTris5.82gSDS0.37g甲醇200ml超純水定容至1000ml4口保存，可重復(fù)利用3次..免疫反應(yīng)封閉PVDF膜正面（靠近膠帶的一面為正面）放盒子中，加入封閉液，室溫?fù)u1黑一抗孵育棄去封閉液，貼壁加入相應(yīng)的一抗，搖床上反應(yīng)60min，放置于4℃，過夜。洗膜緩慢貼壁加入TBST,共洗滌三次，每次在搖床上振搖8-10min。二抗孵育貼壁加入相應(yīng)二抗，搖床上反應(yīng)90min。洗膜緩慢貼壁加入TBST,共洗滌三次，每次在搖床上振搖8-10min。表61義TBS配方10XTBST1OOmlTween-202ml超純水定容到1000ml,4口保存?zhèn)渥ⅲ篢ween-20的黏度大，在用移液槍吸取Tween-20時(shí)要緩慢，待吸取完后，在液面停留一段時(shí)間再從液面