PAGEPAGE8一株麻瘋樹葉部內(nèi)生真菌對四種果樹病原菌的抑菌活性研究張振花余仲東*唐光輝陳輝曹支敏王博(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊陵712100)摘要：采用常規(guī)組織分離法，從麻瘋樹(Jatrophacurcas)葉片內(nèi)部分離得到的一株出現(xiàn)頻率極高的內(nèi)生真菌菌株M1，經(jīng)形態(tài)觀察將M1菌株初步鑒定為一種青霉(Penicilliumfellutanum)，通過與蘋果腐爛病菌、桃流膠病菌、核桃潰瘍病菌和茄腐皮鐮孢菌4種供試病原真菌的平面對峙培養(yǎng)試驗(yàn)表明，M1菌株對4種不同的供試病原菌均有抑制作用，頡頏系數(shù)均達(dá)II級,其中對蘋果腐爛病菌和茄腐皮鐮孢菌的菌落造成變色壞死。該研究說明麻瘋樹內(nèi)生真菌P.fellutanum具有作為生防菌的潛能。關(guān)鍵詞：麻瘋樹；Penicilliumfellutanum；對峙培養(yǎng)；抑制作用AntimicrobialActivityofanEndophyticfungusfromleavesofJatrophacurcasonfourfruittreepathogensZHANGZhenhuaYUZhongdong*TANGGuanghuiCHENHuiCAOZhiminWANGbo（CollegeofForesty，NorthwestA&FUnivesity，YangLing，Shannxi，712100）Abstract：Anendophyticfungi(M1)isolatedfromleavesofJatrophacurcasbytissueisolationmethodwashighfrequentlyappeared，andwasmorphologicallyclassifiedasPenicilliumfellutanum，theantifungalactivitiesagainstCytosporamandushurica、Botryosphaeriadothidea、Fusarimsolaniweretestedbydualculturetechnique．TheresultshowedthatPenicilliumfellutanumhadantifungalactivitiestoalltestedfruittreepathogens，theinhibitionindexreachedgradeII，andcauseddiscolorationandnecrosistothecolonyofCytosporamandushurica、Fusarimsolani．ThestudyshowedthatendophyticfungiPenicilliumfellutanumfromJatrophacurcashasimmensepotentialtoservedasabiocontrolagent．Keywords：Jatrophacurcas；Penicilliumfellutanum；dualculturetechnique；antifungalactivities作者介紹：張振花（1989-），女，碩士研究生，森林保護(hù)學(xué)專業(yè)，聯(lián)系電話作者介紹：張振花（1989-），女，碩士研究生，森林保護(hù)學(xué)專業(yè)，聯(lián)系電話E-mail：hua507@163.com通訊作者：余仲東，副教授，從事森林保護(hù)學(xué)研究，E-mail：yu-10083@163.com基金資助：教育部長江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（NO.IRT1035）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程重大專項(xiàng)資助（2012KTZB02-01-02）內(nèi)生真菌(Endophyte)是指那些在其生活史中的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，幾乎不引起植物病害的微生物[1]。內(nèi)生真菌幾乎存在于所有植物的組織中，其靠宿主來獲取營養(yǎng)和保護(hù)，但也能產(chǎn)生生物活性來提高宿主植物的抗逆性能，例如提高植物抗旱、抗蟲、抗病害等[2]。內(nèi)生真菌種類豐富，數(shù)量龐大，是植物病害生物防治的天然資源，具有廣大的理論研究價(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景，已經(jīng)成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[3]。Botryosphaeriadothidea是桃流膠病、蘋果輪紋病、葡萄潰瘍病、核桃潰瘍病等多種果樹的病原菌，嚴(yán)重威脅我國許多重要果樹的生產(chǎn)安全[4-7]。由Cytsoporasp.引起的蘋果腐爛病有“果樹癌癥”之稱，化學(xué)防治相當(dāng)困難，而且容易造成環(huán)境污染。采用內(nèi)生菌持續(xù)有效防治干部重大病害，是綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然要求，并取得可喜成績。從毛白楊(P.tomentosa)上分離的內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制楊樹潰瘍病菌Botyosphaeriadothidea及其他病原菌的生長[8]。從雜交楊Neva(P.trichocarpa×P.deltoides)上分離的內(nèi)生真菌具有抗真菌和細(xì)菌的活性[9]。從毛白楊上分離的內(nèi)生真菌Chaetomiumspirale防治蘋果潰瘍病取得良好的效果[10]。麻瘋樹(Jatrophacurcas)，也稱小桐子，是大戟科(Euphobiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于熱帶美洲，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)[11]。麻瘋樹不僅具有改善生態(tài)環(huán)境、恢復(fù)植被等生態(tài)功能，而且具有一定的藥用價(jià)值，加之麻瘋樹種子具有很高的含油量，是生產(chǎn)生物柴油的主要能源，所以受到人們的廣泛關(guān)注。目前，對麻瘋樹的研究主要集中在種質(zhì)資源、生理生態(tài)以及毒蛋白的研究[12-14]，而對于麻瘋樹內(nèi)生真菌的研究卻少有報(bào)道。本研究首次從麻瘋樹健康植株的葉片中分離得到一株出現(xiàn)頻率極高的內(nèi)生真菌，并對其進(jìn)行了初步的鑒定，并對其抑菌活性進(jìn)行了研究。該研究為今后利用麻瘋樹內(nèi)生真菌開發(fā)果樹病害生物防治提供了依據(jù)。1材料與方法1.1材料內(nèi)生真菌分離材料采自四川攀枝花引種的麻風(fēng)樹3年生實(shí)生苗，采集時(shí)選取樹體健康，無病蟲害的葉片，進(jìn)行人工分離。供試病原菌：蘋果腐爛病菌(Cytosporamandshurica)、桃流膠病菌(Botryosphaeriadothidea)、核桃潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea)、茄腐皮鐮孢菌(Fusarimsolani)，以上病原菌均由西北農(nóng)林科技大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。所有供試病原菌提前在PDA培養(yǎng)基（含0.5μg/ml硫酸鏈霉素）上恒溫活化培養(yǎng)大約7天后備用。1.2方法1.2.1內(nèi)生真菌的分離與純化內(nèi)生真菌的分離采用常規(guī)的組織分離法。將新鮮的麻瘋樹葉片，首先用自來水沖洗3次，晾干后按照下述方法進(jìn)行消毒：70%的酒精處理30s→無菌水沖洗1次→0.1%Hgcl處理2min→無菌水沖洗3-5次。然后用無菌剪刀將消毒后的葉片剪成2mm×2mm大小，接種于PDA培養(yǎng)基上。同時(shí)取最后一次無菌水洗液涂布與PDA平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)5-7天，若無菌落產(chǎn)生，則表明材料消毒完成，否則不能使用。然后置于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5-7天，待組織切口部位有菌絲長出時(shí)，用無菌接種針挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，純化2-3次后得到單一菌株。1.2.2內(nèi)生真菌M1的鑒定根據(jù)菌落形態(tài)特點(diǎn)，包括大小、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征和子實(shí)體結(jié)構(gòu)，對內(nèi)生真菌M1進(jìn)行初步鑒定[15]。1.2.3內(nèi)生真菌M1抗菌活性的測定采用兩點(diǎn)對峙培養(yǎng)的方法對內(nèi)生真菌抗菌活性進(jìn)行測定。兩點(diǎn)對峙培養(yǎng)：在距離PDA(直徑9cm)平板中心2cm的兩點(diǎn)上，分別接種直徑為9mm的內(nèi)生真菌和供試病原菌的同質(zhì)等量的菌絲塊，每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以只接種病原菌菌絲塊為對照，置于25℃下恒溫培養(yǎng)，3d后開始逐日觀察菌落的生長情況及抑菌作用，同時(shí)觀察內(nèi)生真菌對病原菌的包圍、抑制及覆蓋病原菌菌落的過程。培養(yǎng)5天后記錄對峙培養(yǎng)結(jié)果，劃定拮抗系數(shù)等級[16-17](表1)。表1拮抗系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)Table1ThegradestandardsofInhibitionindex拮抗系數(shù)特征I級內(nèi)生真菌菌絲占據(jù)平板的100%II級內(nèi)生真菌菌絲占據(jù)平板＞2/3III級內(nèi)生真菌菌絲占據(jù)平板＜2/3，＞1/3IV級內(nèi)生真菌菌絲占據(jù)平板＜1/3V級病原菌占據(jù)平板的100%2結(jié)果與分析2.1菌株M1的初步鑒定M1菌株單菌落疏松，生長緩慢，初期白色，后期逐漸變?yōu)槟G色。無色素分泌，培養(yǎng)基無顏色改變，圖1。分生孢子淺綠色，長橢圓形，光滑，無菌核，大小為(4.5～8.2)um×(2.5~3.0)um，分生孢子梗雙層，無足細(xì)胞，頂端不膨大，排列成帚狀間枝，頂層為小梗，小梗長度為(8.5~12.0)×(2.5~3.5)um，小梗上串生分生孢子，圖2。根據(jù)培養(yǎng)生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特征初步鑒定為：叢梗孢目(Moniliales)暗色孢科(Dematiaceae)青霉屬(Penicilliumfellutanump)。圖1菌株在PDA上的培養(yǎng)特征Fig1CulturecharacteristicofisolateM1A：M1菌株在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征(A：正面)，單菌落疏松，生長緩慢，初期白色，后期逐漸變?yōu)槟G色。B：無色素分泌，培養(yǎng)基無顏色改變（B：背面）圖2菌株的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)(×100)Fig2MicroscopecharactreisticofisolateM1(×100)A分生孢子梗ConidiophoreB分生孢子Conidium2.2M1菌株對不同病原菌的抑制作用通過平面對峙實(shí)驗(yàn)的測定，內(nèi)生真菌M1對不同的供試病原菌拮抗程度有所不同。當(dāng)M1與核桃潰瘍病菌（Botryosphaeriadothidea）對峙培養(yǎng)2d時(shí)，病原菌菌落開始受到抑制，培養(yǎng)3-4d時(shí)，M1菌落開始包圍覆蓋病原菌菌落，病原菌已經(jīng)停止生長，培養(yǎng)5-6d時(shí)，完全被M1包圍，整個(gè)過程病原菌幾乎沒有生長，但是對照組病原菌均布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，由于M1菌絲的面積占據(jù)平板的2/3以上，所以判M1菌株對核桃潰瘍病菌的拮抗系數(shù)為II級；當(dāng)M1菌株與桃樹流膠病菌（Botryosphaeriadothidea）對峙培養(yǎng)3d時(shí)病原菌開始受到抑制，培養(yǎng)4-5d時(shí)，M1開始接觸病原菌，培養(yǎng)6-7d，病原菌菌落不再繼續(xù)生長，拮抗系數(shù)也為II級，病原菌菌落與M1菌株菌落形成明顯的分界區(qū)，圖3。圖3M1對核桃潰瘍病和桃流膠病的拮抗作用注：A：M1對核桃潰瘍病的拮抗作用；B：M1對桃流膠病的拮抗作用Fig3TheantagonisticactivitiesofM1toBotryosphaeriadothideafromwallnutandpeachNote：A：TheantagonisticactivitiesofM1toBotryosphaeriadothideafromwallnutB：TheantagonisticactivitiesofM1toBotryosphaeriadothideafrompeach當(dāng)M1與蘋果腐爛病病原菌（Cytosporamandshurica）平面對峙培養(yǎng)3-4d時(shí)，內(nèi)生真菌開始包圍病原菌菌落，培養(yǎng)5-6d時(shí)，病原菌生長受到抑制，同時(shí)病原菌停止生長，菌落開始萎縮，同時(shí)菌落周圍出現(xiàn)明顯的變色區(qū)域，菌絲由白色變?yōu)楹谏纬擅黠@的抑菌區(qū)，而對照組病原菌生長正常，沒有受到抑制，M1菌株的菌絲占據(jù)平板的面積＞2/3，M1對Cytosporamandshurica的拮抗系數(shù)為II級，當(dāng)M1菌株與病原菌Fusarimsolani培養(yǎng)2d時(shí)，內(nèi)生真菌開始包圍病原菌菌落，培養(yǎng)3-4d時(shí)，病原菌停止生長，同時(shí)病原菌菌落周圍出現(xiàn)變色，培養(yǎng)5-6d時(shí)，病原菌完全被M1包圍，此時(shí)變色范圍明顯變大，整個(gè)病原菌菌落由淺紫色變?yōu)辄S色，圖4。圖4M1對蘋果腐爛病和腐皮鐮孢菌的拮抗作用Fig4TheantagonisticactivitiesofM1toCytosporamandshuricaandFusarimsolani注：A：M1對蘋果腐爛病的拮抗作用；B：M1對腐皮鐮孢菌的拮抗作用Note：A：TheantagonisticactivitiesofM1toCytosporamandshuricaB：TheantagonisticactivitiesofM1toFusarimsolani3結(jié)論與討論內(nèi)生真菌是與宿主植物短暫或長期共生的真菌，不僅能夠提高宿主植物的生長，而且能夠誘導(dǎo)啟動植物的抵抗機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗性等，利用植物內(nèi)生真菌防治植物病害已經(jīng)成為當(dāng)今對植物病害生物防治的優(yōu)先選擇[18]。目前對于麻瘋樹內(nèi)生真菌的研究很少，至今只有少數(shù)人對麻瘋樹根部、莖部內(nèi)生真菌做過研究外[19-20]，而對于麻瘋樹葉部內(nèi)生真菌的研究還沒有。本研究首次從麻瘋樹葉片中分離出一株出現(xiàn)頻率極高的內(nèi)生真菌Penicilliumfellutanum，并就其對不同病原菌的抑菌活性進(jìn)行了研究，最終結(jié)果表明此株內(nèi)生真菌對核桃潰瘍病菌Botryosphaeriadothidea、蘋果腐爛病菌Cytosporamandshurica、桃流膠病菌Botryosphaeriadothidea、茄腐皮鐮孢菌Fusarimsolani具有非常明顯的抑制作用，抑菌系數(shù)為II級，這為今后利用內(nèi)生真菌防治果樹病害提供有利的微生物資源。本研究只是對麻瘋樹葉片內(nèi)生真菌的初步探討，由于內(nèi)生真菌具有多樣性以及受采樣數(shù)量和采樣地點(diǎn)等的限制，麻瘋樹葉片內(nèi)生真菌的種類、數(shù)量、多樣性及田間應(yīng)用等還需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]ShanTJ，LouJF，GaoS，Zhou 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