NKG2D介導(dǎo)NK細(xì)胞對(duì)鼻咽癌細(xì)胞殺傷作用的體外研究【摘要】目的探討鼻咽癌CNE2細(xì)胞表面HLAI類分子表型和NKG2D配體的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解其對(duì)同種異體NK細(xì)胞殺傷活性的影響。方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)NKG2D的配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3在K562、CNE2細(xì)胞的表達(dá)情況。PCRSSP法分析CNE2細(xì)胞HLAA、B、Cw分型和NK細(xì)胞KIR分型。LDH釋放法測(cè)定5例健康者NK細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)K562、CNE2細(xì)胞的殺傷活性，效靶比20∶1時(shí)觀察抗NKG2D配體的單抗對(duì)NK細(xì)胞殺傷K562、CNE2細(xì)胞活性的影響。結(jié)果CNE2細(xì)胞表達(dá)MICA、MICB、ULBP2，不表達(dá)ULBP1、ULBP3。K562細(xì)胞表面表達(dá)MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。5例健康者NK細(xì)胞抑制性KIR與CNE2細(xì)胞表面的HLAI類分子之間存在錯(cuò)配。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562、CNE2細(xì)胞的殺傷活性分別為(±)%、(±)%；(±)%、(±)%；(±)%、(±)%；(±)%、(±)%,在各效靶比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性較CNE2細(xì)胞明顯增強(qiáng)(Ｐ=)；在效靶比20∶1時(shí)antiMICA、antiMICB、antiULBP1、antiULBP2、antiULBP3可明顯抑制NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，與阻斷前相比有顯著性差異(Ｐ=)；antiMICA、antiMICB、antiULBP2可明顯抑制NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性，與阻斷前相比有顯著性差異(Ｐ)，但antiULBP1、antiULBP3不能阻斷NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)論NKG2D配體影響NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，提高NKG2D配體的表達(dá)有可能提高NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。

【關(guān)鍵詞】自然殺傷細(xì)胞；NKG2D；殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體

Abstract：ObjectiveToanalyzeHLAclassImoleculesandtheexpressionofNKG2Dligandsinhumannasopharyngealcarcinomacellline(CNE2)andtheireffectsoncytotoxicityofnaturalkiller(NK)cells.MethodsTheexpressionofNKG2DligandsonthesurfaceofCNE2andK562cellswereanalyzedbyflowcytometry.TheHLAclassImoleculesinCNE2cellsandkillercellimmunoglobulinlikereceptors(KIR)expressedbyNKcells(isolatedfrom5healthypersons)wereanalyzedbyPCRSSP.CytotoxicitiesofNKcellsagainstCNE2andK562cellsweredetectedbyLDHreleasingassayatdifferenteffecttotargetcellratios(E∶T).Inblockingexperiments,differentantiNKG2Dligandsmonoclonalantibodies(mAbs)wereaddedtothetargetcellsat20∶1E∶Tratio.ResultsItwasfoundthatMICA,MICB,ULBP2wereexpressedbyCNE2,ULBP1,ULBP3werenotdetectableonCNE2;K562expressedalltheNKG2Dligands.ThereweremismatchesbetweeninhibitoryKIRsexpressedbyNKcellsandHLAclassImoleculesexpressedbytheCNE2cells.NKcellsdisplayedhighlyinvitrocytotoxicityagainstK562andCNE2cellswithanlysisof(±)%,(±)%;(±)%,(±)%;(±)%,(±)%;(±)%,(±)%respectivelyat5∶1，10∶1,20∶1,30∶1E∶Tratios(P=).BlockingexperimentsconfirmedthatkillingofK562byNKcellswasefficientlyinhibitedbyantiMICAmAb,antiMICBmAb,antiULBP1mAb,antiULBP2mAbandantiULBP3mAb.antiMICAmAb.AntiMICBmAb,antiULBP2mAbcouldpartiallyinhibitthecytotoxicityofNKcellsagainstCNE2cells,whereasantiULBP1mAbandantiULBP3mAbcouldnotinhibitthecytotoxicityofNKcells.ConclusionExpressionofNKG2DligandsiscorrelatedwiththecytotoxicityofNKcells.NKmediatedcytolyticactivitymaybeboostedbyengineeringcellsexpressinghighlevelsofactivatingNKG2Dligands.

Keywords：Naturalkillercell;NKG2D;Killercellimmunoglobulinlikereceptor

0引言

NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性與其細(xì)胞表面的受體和靶細(xì)胞表面的配體密切相關(guān)。NK細(xì)胞表面的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Inhibitorykillercellimmunoglobulinlikereceptor,iKIR)與靶細(xì)胞表面特定的HLAI類分子結(jié)合可以明顯抑制NK細(xì)胞的活性，靶細(xì)胞缺乏iKIR特定的配體將激發(fā)NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性[1]。NKG2D為NK細(xì)胞的活化性受體，表達(dá)于所有的NK細(xì)胞表面，是介導(dǎo)NK細(xì)胞識(shí)別和溶解腫瘤細(xì)胞的主要活化性受體。NKG2D的配體為MHCI類鏈相關(guān)基因產(chǎn)物(MICA、MICB)及ULBPS(人巨細(xì)胞病毒UL16蛋白的結(jié)合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D的配體在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)，其在鼻咽癌細(xì)胞的表達(dá)尚未見報(bào)道。本研究主要探討鼻咽癌CNE2細(xì)胞株HLAI類分子表型和NKG2D配體的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解其對(duì)同種異體NK細(xì)胞殺傷活性的影響。

1材料和方法

材料

NK細(xì)胞分離緩沖液及CD56MicroBeads，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1，RPMI1640(Gibco公司)，淋巴細(xì)胞分離液，rhIL2(上海華新公司)，NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)試劑盒(CytoTox96NonRadioactiveCytotoxocityAssay，Promega公司)，KIRPCRSSP分型試劑盒(Dynal公司)，PCRSSPA、B、Cw特異性引物試劑盒，流式細(xì)胞儀(Coulter公司)，AMO1(antiMICA，IgG1)，BMO1(antiMICB，IgG1)，M295(antiULBP1，IgG1)，M310/×100%

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

NK細(xì)胞的純度

流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3－CD16+CD56+細(xì)胞的純度達(dá)90%以上。

K562、CNE2細(xì)胞表面NKG2D的配體表達(dá)

本研究結(jié)果顯示CNE2細(xì)胞表面MICA、MICB、ULBP1的表達(dá)率分別為(±)%、(±)%、(±)%，不表達(dá)ULBP1、ULBP3；K562細(xì)胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表達(dá)率分別為(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%，見表1。表1NKG2D的配體在K562、CNE2細(xì)胞表面表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(略)

CNE2細(xì)胞表面HLAA、B、Cw基因分型結(jié)果

CNE2細(xì)胞表面HLAA、B、Cw表型為A2,24；B18,35；Cw4,7。

KIR基因分型

5例健康人均表達(dá)KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。

NK細(xì)胞殺傷活性

本研究結(jié)果顯示NK細(xì)胞對(duì)K562、CNE2細(xì)胞的殺傷活性在效靶比5∶1時(shí)分別為(±)%、(±)%；效靶比10∶1時(shí)分別為(±)%、(±)%；效靶比20∶1時(shí)分別為(±)%、(±)%；效靶比30∶1時(shí)分別為(±)%、(±)%，在各效靶比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性較CNE2細(xì)胞明顯增強(qiáng)；效靶比20∶1時(shí)AMO1、BMO1、M295、M310、M551分別對(duì)K562細(xì)胞表面相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉,NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性分別為(±)%、(±)%、(±)%、(±)%、(±)%和阻斷前(±)%相比有顯著性差異,見圖1;效靶比20∶1時(shí)AMO1、BMO1、M310分別對(duì)CNE2細(xì)胞表面相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉,NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性分別為(±)%、(±)%、(±)%與阻斷前(±)%相比有顯著性差異；M295、M551對(duì)CNE2細(xì)胞表面相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉,NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞的殺傷活性分別為(±)%、(±)%，與阻斷前相比無明顯變化,見圖2。

3討論

NK細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的淋巴細(xì)胞亞群,在腫瘤免疫中NK細(xì)胞構(gòu)成了第一道殺傷防線。NK細(xì)胞表面的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(iKIR）與靶細(xì)胞表面特定的HLAI類分子結(jié)合可以明顯抑制NK細(xì)胞的活性，靶細(xì)胞缺乏iKIR特定的配體(KIR配體錯(cuò)配)將激發(fā)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性[1]。不同的iKIR分子識(shí)別并結(jié)合不同的HLAI類分子。KIR2DL1識(shí)別HLACw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3識(shí)別HLACw1、Cw3、Cw7、Cw8；KIR3DL1識(shí)別HLABw4；KIR3DL2識(shí)別HLAA3、A11；其余的KIR配體尚未明確。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影響NK細(xì)胞同種異體反應(yīng)性的主要抑制性受體[1]。

NKG2D是1991年Houchins等在NK細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，NKG2D除表達(dá)在所有NK細(xì)胞上外，在絕大多數(shù)γδT細(xì)胞、CD8+αβT細(xì)胞上也有表達(dá)。人NKG2D的配體分為兩大類：第一類包括MICA、MICB，屬于非經(jīng)典的HLAI類基因，集中表達(dá)于胃腸道上皮細(xì)胞表面，在大多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞如肺癌、乳腺癌、腎癌及卵巢癌、結(jié)腸癌腫瘤組織中也有表達(dá)。第二類人NKG2D配體由ULBP1、ULBP2、ULBP3組成，均帶有MHC樣α1、α2結(jié)構(gòu)域，并通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定在細(xì)胞表面，其表達(dá)較廣泛，可以表達(dá)于多種細(xì)胞、組織、腫瘤，是NKG2D發(fā)揮殺傷活性的主要配體。

研究表明，由于腫瘤細(xì)胞的MHCI類分子丟失或變異，使得特異性MHC限制性的細(xì)胞毒T細(xì)胞不能發(fā)揮作用，在這種情況下，識(shí)別非MHCI類分子的NKG2D在介導(dǎo)NK細(xì)胞識(shí)別和溶解腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NKG2D通過與靶細(xì)胞表面誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)配體結(jié)合，然后結(jié)合轉(zhuǎn)接蛋白向NK細(xì)胞傳遞活化信號(hào)，使NK細(xì)胞獲得攻擊靶細(xì)胞的能力，另外還可能為CD8+T細(xì)胞提供必要的協(xié)同刺激信號(hào)。在很大程度上NKG2D的活化決定了機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫水平。

本研究表明CNE2細(xì)胞表達(dá)MICA、MICB、ULBP2，不表達(dá)ULBP1、ULBP3；CNE2細(xì)胞表面HLAA、B、Cw表型為A2，24、B18，35、Cw4，7，不表達(dá)BW4、A3、A11分子，因此5例健康個(gè)體體內(nèi)表達(dá)KIR3DL1、KIR3DL2的NK細(xì)胞與CNE2細(xì)胞之間存在KIR配體錯(cuò)配現(xiàn)象。有研究表明94%個(gè)體表達(dá)KIR3DL1，KIR3DL2為NK細(xì)胞的框架基因，任意個(gè)體的NK細(xì)胞均表達(dá)KIR3DL2，因此任意個(gè)體的NK細(xì)胞均與CNE2細(xì)胞之間存在著KIR配體錯(cuò)配現(xiàn)象，結(jié)合NKG2D配體的檢測(cè)結(jié)果表明任意個(gè)體的NK細(xì)胞都存在殺傷CNE2細(xì)胞的分子基礎(chǔ)。本研究顯示NK細(xì)胞對(duì)CNE2細(xì)胞有較高的殺傷活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP2均可不同程度地抑制NK細(xì)胞對(duì)CNE2的殺傷活性，說明NKG2D在NK細(xì)胞殺傷CNE2細(xì)胞中起主導(dǎo)作用。

K562細(xì)胞不表達(dá)HLAI類分子，因此任意個(gè)體的NK細(xì)胞都與之存在KIR配體錯(cuò)配現(xiàn)象，本研究結(jié)果表明K562細(xì)胞表達(dá)MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞具有較高的殺傷活性，antiMICA、antiMICB、antiULBP1、antiULBP2、antiULBP3均可不同程度地抑制NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，說明NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞通過NKG2D發(fā)揮作用。

研究表明[79]，腫瘤細(xì)胞表面NKG2D配體在體內(nèi)存在膜型和可溶性兩種形式，可溶性NKG2D配體與NKG2D的結(jié)合可誘導(dǎo)T、NK細(xì)胞表面NKG2D的內(nèi)化和降解，下調(diào)NKG2D表達(dá)，進(jìn)而嚴(yán)重?fù)p害腫瘤抗原特異性T細(xì)胞效應(yīng)，同時(shí)削弱NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。鼻咽癌患者體內(nèi)是否存在高濃度的可溶性NKG2D配體，能否作為患者的臨床預(yù)后指標(biāo)，值得我們進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

［1］HsuKC,KeeverTaylorCA,WiltonA,etal.ImprovedoutcomeinHLAidenticalsiblinghematopoieticstemcelltransplantationforacutemyelogenousleukemiapredictedbyKIRandHLAgenotypes[J].Blood,2005,105(12):48784884.

姜潤(rùn)德,張立新,岳文，等.人鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系(CNE2/DDP)的建立及耐藥相關(guān)基因的篩選[J].癌癥,2003,22(4):337345.

VilchesC,ParhamP.KIR:diverse,rapidlyevolvingreceptorsofinnateandadaptiveimmunity[J].AnnuRevImmunol,2002,20(1):217251.

FaragSS,FehnigerTA,RuggeriL,etal.Naturalkillercellreceptors:newbiologyandinsightsintothegraftversusleukemiaeffect[J].Blood,2002,100(6):19351947.

JamiesonAM,DiefenbachA,McMahonCW,etal.TheroleoftheNKG2Dimmunoreceptorinimmunecellactivationandnaturalkilling[J