第八章免疫標記技術(shù)演示文稿1本文檔共135頁；當前第1頁；編輯于星期六\11點44分優(yōu)選第八章免疫標記技術(shù)本文檔共135頁；當前第2頁；編輯于星期六\11點44分3免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原所進行的抗原抗體反應(yīng);三大標記技術(shù):

同位素標記技術(shù)免疫熒光技術(shù)

酶免疫測定本文檔共135頁；當前第3頁；編輯于星期六\11點44分4標記免疫技術(shù)1.免疫熒光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）3.放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）4.化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）

5免疫印跡法（immunoblotting,Westernblot)本文檔共135頁；當前第4頁；編輯于星期六\11點44分5第一節(jié)放射免疫測定法

（radioimmunoassay,RIA）本文檔共135頁；當前第5頁；編輯于星期六\11點44分6

放射性同位素(131I,或125I)標記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測定微量物質(zhì):如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。本文檔共135頁；當前第6頁；編輯于星期六\11點44分7VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

本文檔共135頁；當前第7頁；編輯于星期六\11點44分8

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析技術(shù)測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代，是微量分析方法學(xué)上的一個突破。本文檔共135頁；當前第8頁；編輯于星期六\11點44分9優(yōu)點：①特異性強，即抗原抗體的特異性反應(yīng)；②靈敏度高，結(jié)果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復(fù)雜的提純步驟；⑤應(yīng)用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。本文檔共135頁；當前第9頁；編輯于星期六\11點44分10原理

是建立在標記抗原（或配體）和待測抗原（或配體）對有限量的特異性抗體（或受體）的競爭性抑制反應(yīng)基礎(chǔ)上的，最終形成的放射性標記復(fù)合物與被測配體（或抗原）呈負相關(guān)，因而亦稱競爭性放射免疫技術(shù)。本文檔共135頁；當前第10頁；編輯于星期六\11點44分11

Ag*+ Ab?Ag*-Ab

（F）（B）

+Ag ?Ag-Ab

本文檔共135頁；當前第11頁；編輯于星期六\11點44分12RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/8本文檔共135頁；當前第12頁；編輯于星期六\11點44分13返回本文檔共135頁；當前第13頁；編輯于星期六\11點44分14

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)本文檔共135頁；當前第14頁；編輯于星期六\11點44分15原理

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標記以熒光素，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀（熒光顯微鏡或用流式細胞儀）測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;

巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。本文檔共135頁；當前第15頁；編輯于星期六\11點44分16本文檔共135頁；當前第16頁；編輯于星期六\11點44分17激發(fā)光和發(fā)射光本文檔共135頁；當前第17頁；編輯于星期六\11點44分18

抗原抗體反應(yīng)的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術(shù)的高度精確性

準確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質(zhì)。本文檔共135頁；當前第18頁；編輯于星期六\11點44分19優(yōu)點：

特異性強，速度快，敏感性高，能準確檢測少量抗原或抗體在組織細胞內(nèi)的定位分布。缺點：

非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足。

返回本文檔共135頁；當前第19頁；編輯于星期六\11點44分20建立技術(shù)的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備3．熒光檢測儀返回本文檔共135頁；當前第20頁；編輯于星期六\11點44分21熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。本文檔共135頁；當前第21頁；編輯于星期六\11點44分22

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光本文檔共135頁；當前第22頁；編輯于星期六\11點44分23常用的熒光素返回本文檔共135頁；當前第23頁；編輯于星期六\11點44分24熒光檢測儀

（1）熒光顯微鏡（2）熒光分光光度計（3）流式細胞儀（4）熒光偏振光分析儀

本文檔共135頁；當前第24頁；編輯于星期六\11點44分25熒光顯微鏡本文檔共135頁；當前第25頁；編輯于星期六\11點44分26熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈本文檔共135頁；當前第26頁；編輯于星期六\11點44分27分類：（1）直接熒光法:

（2）間接熒光法:

（3）流式細胞術(shù)(flowcytometry):

樣品(細胞)經(jīng)各種熒光素標記的不同抗體染色后可同時分析細胞表達的多種分子。本文檔共135頁；當前第27頁；編輯于星期六\11點44分28(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標記在特異性抗體上，直接檢測抗原。本文檔共135頁；當前第28頁；編輯于星期六\11點44分29返回本文檔共135頁；當前第29頁；編輯于星期六\11點44分30②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復(fù)合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標記在第二抗體（抗抗體）上或標記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。本文檔共135頁；當前第30頁；編輯于星期六\11點44分31本文檔共135頁；當前第31頁；編輯于星期六\11點44分32③補體熒光染色法：

將熒光素標記在補體的抗體上（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物?？蓹z測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補體易失活、需新鮮制備不方便。本文檔共135頁；當前第32頁；編輯于星期六\11點44分33本文檔共135頁；當前第33頁；編輯于星期六\11點44分34本文檔共135頁；當前第34頁；編輯于星期六\11點44分35特殊染色法

①

雙標記免疫熒光技術(shù)②雙色免疫熒光技術(shù)③反襯染色法

返回本文檔共135頁；當前第35頁；編輯于星期六\11點44分36①雙標記免疫熒光技術(shù)

在同一標本中，可用兩種不同顏色的熒光標記抗體進行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同類型的抗原。如：FITC（黃綠色熒光）和RB200或TRITC9（桔紅色熒光）。本文檔共135頁；當前第36頁；編輯于星期六\11點44分37②雙色免疫熒光技術(shù)

如FITC標記抗體和細胞核染色劑PI（碘化丙錠）。

本文檔共135頁；當前第37頁；編輯于星期六\11點44分38雙重染色標本的單色和雙色觀察WU

WIBDUALBANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI本文檔共135頁；當前第38頁；編輯于星期六\11點44分39多重染色標本的多色觀察（FITC+TexasRed+DAPI）返回本文檔共135頁；當前第39頁；編輯于星期六\11點44分40本文檔共135頁；當前第40頁；編輯于星期六\11點44分41③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標記，用FITC標記特異性抗體。本文檔共135頁；當前第41頁；編輯于星期六\11點44分42本文檔共135頁；當前第42頁；編輯于星期六\11點44分43流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)

是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)于一體,同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

本文檔共135頁；當前第43頁；編輯于星期六\11點44分44本文檔共135頁；當前第44頁；編輯于星期六\11點44分45FACS組成示意圖本文檔共135頁；當前第45頁；編輯于星期六\11點44分Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)本文檔共135頁；當前第46頁；編輯于星期六\11點44分47流式細胞儀實驗原理本文檔共135頁；當前第47頁；編輯于星期六\11點44分48本文檔共135頁；當前第48頁；編輯于星期六\11點44分49表達量檢測

本文檔共135頁；當前第49頁；編輯于星期六\11點44分50細胞凋亡研究

PI染色本文檔共135頁；當前第50頁；編輯于星期六\11點44分51AV-PI雙染色本文檔共135頁；當前第51頁；編輯于星期六\11點44分52血液學(xué)應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等本文檔共135頁；當前第52頁；編輯于星期六\11點44分53胞內(nèi)細胞因子的檢測本文檔共135頁；當前第53頁；編輯于星期六\11點44分54T細胞亞群分析本文檔共135頁；當前第54頁；編輯于星期六\11點44分55第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

（enzymeimmunoassaytechnique）

1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學(xué)者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)（enzymeimmunoassay，EIA）。本文檔共135頁；當前第55頁；編輯于星期六\11點44分56第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術(shù)是通過適當?shù)拿复倩瘜W(xué)反應(yīng)和免疫反應(yīng)，使抗體（或抗原）與酶蛋白分子結(jié)合，形成酶標抗體（或抗原）,該結(jié)合物保留免疫學(xué)活性的酶活性,因而既有抗原抗體反應(yīng)特異性,又有酶促反應(yīng)的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗――ELISA本文檔共135頁；當前第56頁；編輯于星期六\11點44分57一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。本文檔共135頁；當前第57頁；編輯于星期六\11點44分58優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器（低廉）定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復(fù)性好；⑥可用于定位組織細胞上的抗原或抗體成分。缺點：

標記反應(yīng)較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。本文檔共135頁；當前第58頁；編輯于星期六\11點44分59

建立技術(shù)的條件

1．標記酶2．免疫酶結(jié)合物的制備3．酶標檢測儀本文檔共135頁；當前第59頁；編輯于星期六\11點44分60常用的標記酶

①辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）②堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）③葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）④-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）本文檔共135頁；當前第60頁；編輯于星期六\11點44分61本文檔共135頁；當前第61頁；編輯于星期六\11點44分62本文檔共135頁；當前第62頁；編輯于星期六\11點44分63二、基本類型均相酶免疫測定法酶增強免疫技術(shù)；酶減弱免疫技術(shù)；輔基標記技術(shù)2.非均相酶免疫測定法

ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法）1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）本文檔共135頁；當前第63頁；編輯于星期六\11點44分64直接ELISA間接ELISA（用于檢測Ab）本文檔共135頁；當前第64頁；編輯于星期六\11點44分65directELISA（forAg）本文檔共135頁；當前第65頁；編輯于星期六\11點44分66directELISA（forAb）返回本文檔共135頁；當前第66頁；編輯于星期六\11點44分67本文檔共135頁；當前第67頁；編輯于星期六\11點44分68本文檔共135頁；當前第68頁；編輯于星期六\11點44分69返回本文檔共135頁；當前第69頁；編輯于星期六\11點44分70

（3）夾心法

（sandwichassay）本文檔共135頁；當前第70頁；編輯于星期六\11點44分71夾心法本文檔共135頁；當前第71頁；編輯于星期六\11點44分72雙夾心法返回本文檔共135頁；當前第72頁；編輯于星期六\11點44分73本文檔共135頁；當前第73頁；編輯于星期六\11點44分74本文檔共135頁；當前第74頁；編輯于星期六\11點44分75ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復(fù)合物，洗滌加該Ag的另一Ab（酶標），洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復(fù)合物，洗滌加酶標二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反應(yīng)板本文檔共135頁；當前第75頁；編輯于星期六\11點44分76本文檔共135頁；當前第76頁；編輯于星期六\11點44分77抗酶抗體法（PAP）本文檔共135頁；當前第77頁；編輯于星期六\11點44分78血清IgE的檢測實驗材料酶標板（聚苯乙烯微量板）馬抗人抗體—（購自北京中山公司）辣根過氧化物酶（）標記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反應(yīng)終止液：本文檔共135頁；當前第78頁；編輯于星期六\11點44分79實驗方法包被酶標反應(yīng)板：加馬抗人抗體（），孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標記抗體：加入適當稀釋度的酶標抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：加入（鄰苯二胺）溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：加入，孔

↓內(nèi)，用酶標儀測定各孔值，測定波長實驗結(jié)果

用待測標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均吸收值的比值（）

表示，當大于某一數(shù)值時（如）判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。本文檔共135頁；當前第79頁；編輯于星期六\11點44分80（4）競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 本文檔共135頁；當前第80頁；編輯于星期六\11點44分81

a．固相抗體競爭法本文檔共135頁；當前第81頁；編輯于星期六\11點44分82

b．固相抗原競爭法返回本文檔共135頁；當前第82頁；編輯于星期六\11點44分83夾心ELISA競爭ELISA（用于檢測大分子Ag）（用于檢測小分子Ag）本文檔共135頁；當前第83頁；編輯于星期六\11點44分84返回（5）抗體橋聯(lián)法

（immunobridge）本文檔共135頁；當前第84頁；編輯于星期六\11點44分85（6）抗酶抗體法

（peroxidase-antiperoxidase，PAP）本文檔共135頁；當前第85頁；編輯于星期六\11點44分86PO

抗

PO法返回本文檔共135頁；當前第86頁；編輯于星期六\11點44分87酶聯(lián)免疫斑點法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

本文檔共135頁；當前第87頁；編輯于星期六\11點44分88本文檔共135頁；當前第88頁；編輯于星期六\11點44分89ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。本文檔共135頁；當前第89頁；編輯于星期六\11點44分90原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。本文檔共135頁；當前第90頁；編輯于星期六\11點44分91DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞（直接法），或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中（間接法）。方法選擇基于：1）檢測細胞的類型；2）希望得到的細胞量。若只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。本文檔共135頁；當前第91頁；編輯于星期六\11點44分92ElISPOT操作過程本文檔共135頁；當前第92頁；編輯于星期六\11點44分93本文檔共135頁；當前第93頁；編輯于星期六\11點44分94本文檔共135頁；當前第94頁；編輯于星期六\11點44分95本文檔共135頁；當前第95頁；編輯于星期六\11點44分96操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體加入10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔加入100ul2%脫脂乳PBS（見試劑準備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔加入100ul細胞懸浮液（含適當量的細胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接Eli-spot）。蓋上標準的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。本文檔共135頁；當前第96頁；編輯于星期六\11點44分9711.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔加入100ulBCIP/NBT。17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。本文檔共135頁；當前第97頁；編輯于星期六\11點44分98本文檔共135頁；當前第98頁；編輯于星期六\11點44分99本文檔共135頁；當前第99頁；編輯于星期六\11點44分100本文檔共135頁；當前第100頁；編輯于星期六\11點44分101返回本文檔共135頁；當前第101頁；編輯于星期六\11點44分102本文檔共135頁；當前第102頁；編輯于星期六\11點44分103四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回本文檔共135頁；當前第103頁；編輯于星期六\11點44分104（1）SPA的發(fā)現(xiàn)

1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)本文檔共135頁；當前第104頁；編輯于星期六\11點44分105Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為非特異免疫反應(yīng)。生產(chǎn)SPA的國際標準菌株:CowanⅠ株（NcTc8530和ATCC12598）不生產(chǎn)SPA的標準株:Wood46

返回本文檔共135頁；當前第105頁；編輯于星期六\11點44分106（2）顆粒SPA的應(yīng)用

協(xié)同凝集試驗SPA吸收IgG試驗應(yīng)用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回本文檔共135頁；當前第106頁；編輯于星期六\11點44分107（3）SPA的標記和應(yīng)用

熒光素標記SPA及應(yīng)用酶標記SPA及應(yīng)用

本文檔共135頁；當前第107頁；編輯于星期六\11點44分108酶標SPA法返回本文檔共135頁；當前第108頁；編輯于星期六\11點44分109ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem）

高度特異性高度靈敏性簡單快速安全穩(wěn)定

本文檔共135頁；當前第109頁；編輯于星期六\11點44分110（1）生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性

生物素（biotin，B）又稱維生素H、輔酶R（羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶）

MW244.31，pI3.5

分子式為C10H16O3N2S本文檔共135頁；當前第110頁；編輯于星期六\11點44分111本文檔共135頁；當前第111頁；編輯于星期六\11點44分112Biotin本文檔共135頁；當前第112頁；編輯于星期六\11點44分113親合素（avidin，A）

又稱卵白蛋白、抗生物素。

MW68,000，pI10～10.5，為堿性蛋白，含糖量高達10%；

1個親合素可與4個生物素結(jié)合；

Ka=1015mol/L本文檔共135頁；當前第113頁；編輯于星期六\11點44分114鏈霉親合素（streptavidin，SA）：

是Streptomycesavidin菌分泌的一種蛋白質(zhì)。

MW65000，pI6.0，為略偏酸性的蛋白，不含任何糖基

1個鏈霉親合素可與4個生物素結(jié)合

Ka=1015mol/LSA比A在實際應(yīng)用中靈敏度要高、非特異性反應(yīng)要少。返回本文檔共135頁；當前第114頁；編輯于星期六\11點44分115（2）生物素的標記技術(shù)

生物素的活化活化生物素結(jié)合物的制備活化生物素可結(jié)合或偶聯(lián)抗體、酶、蛋白質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等

本文檔共135頁；當前第115頁；編輯于星期六\11點44分116（4）生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用本文檔共135頁；當前第116頁；編輯于星期六\11點44分117返回本文檔共135頁；當前第117頁；編輯于星期六\11點44分118四、ELISA方法的發(fā)展1.酶聯(lián)免疫熒光測定法本文檔共135頁；當前第118頁；編輯于星期六\11點44分1192.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗（IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA)本文檔共135頁；當前第119頁；編輯于星期六\11點44分1203.斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA)本文檔共135頁；當前第120頁；編輯于星期六\11點44分121本文檔共135頁；當前第121頁；編輯于星期六\11點44分122三、免疫金溶膠技術(shù)本文檔共135頁；當前第122頁；編輯于星期六\11點44分123

膠體金試紙條診斷是采用斑點免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素（HCG）的測定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等檢測。（4）斑點免疫層析試驗

（dotimmunochromatographicassay,DICA)本文檔共135頁；當