PCR技術(shù)介紹原理01以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成原理011234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~35輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍基本實(shí)驗(yàn)步驟02核酸模板引物

反應(yīng)緩沖系統(tǒng)TaqDNA聚合酶

4種dNTPMg2+

包括Tris-HCl（維持PH值），KCl（利于引物的退火），Taq聚合酶保護(hù)劑PCR的特異性（3’端和5’端；18-25bp；0.1-0.5μM；Tm值；4種堿基隨機(jī)分布；自身避免反向重復(fù)序列；引物之間不存在互補(bǔ)序列；3’端選擇保守的氨基酸序列；與非特異性序列的同源性）PCR的合成原料，四種dNTP濃度應(yīng)相等耐高溫，在熱變性時(shí)不會被鈍化使DNA聚合酶具有催化活性DNA/RNA，線性，小片段模板，核酸樣品應(yīng)除去存在對DNA聚合酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和金屬離子基本實(shí)驗(yàn)步驟02實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置變性的溫度與時(shí)間退火的溫度與時(shí)間延伸的溫度與時(shí)間循環(huán)數(shù)

溫度取決于DNA模板及PCR產(chǎn)物的G+C含量，時(shí)間取決于DNA的長度（95℃）溫度取決于引物的G+C含量及引物的長度，退火時(shí)間不是關(guān)鍵因素，但也應(yīng)該加以控制（60℃）溫度取決于DNA聚合酶的最適溫度，時(shí)間和待擴(kuò)增片段長度有關(guān)（72℃）PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度（30-40次）基本實(shí)驗(yàn)步驟02PCR產(chǎn)物檢測瓊脂糖凝膠電泳EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長為254nm~365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光瓊脂糖凝膠板的制備(1.5%)加樣電泳（電壓80V、時(shí)間2hr）紫外衍生PCR技術(shù)03PCR技術(shù)巢式PCR原位PCR多重PCR定量PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR相對于基本PCR，在開始階段增加步驟：RNA→cDNA合成，是單鏈到雙鏈的過程。引物逆轉(zhuǎn)錄酶RNA水解酶RealTimeqPCR熒光嵌合法(TBGreen?)熒光探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法?；€（Baseline）是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光閾值（threshold）

一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期Ct(Cyclethreshold)值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)RealTimeqPCR。固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比。初始DNA量越多,熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct值)越少。起始模板的對數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。RealTimeqPCR熔解曲線確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性。Ct值無數(shù)值（undetected）陰性

Ct值≤30.0陽性Ct值>30.0表達(dá)量極少RealTimeqPCR相對定量法分析結(jié)果內(nèi)參/管家基因GAPDH、β