第1

節(jié)

分子印跡與雜交技術

本文檔共61頁；當前第1頁；編輯于星期二\2點59分一、核酸分子印跡與雜交技術核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

把不同來源而具有一定同源性的DNA分子放在同一溶液中做變性處理，或把單鏈DNA與RNA放在一起，在一定條件下，它們之間的同源區(qū)域可按堿基互補原則復性形成雜合雙鏈(heteroduplex)

，這一過程稱為雜交。本文檔共61頁；當前第2頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第3頁；編輯于星期二\2點59分

在雜交之前，通常用瓊脂糖凝膠分離待測的DNA分子，再將分離的DNA片段轉移到特定的支持物上。由于轉移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一樣，故稱為印跡（blotting）。印跡（blotting）本文檔共61頁；當前第4頁；編輯于星期二\2點59分（一）Southern印跡雜交

Southern印跡雜交（Southernblotting）是指DNA與DNA分子之間的雜交。其基本過程是將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測DNA片段變性后，將凝膠中的DNA分子轉移到一定的固相支持物上，然后用標記的探針檢測待測的DNA。本文檔共61頁；當前第5頁；編輯于星期二\2點59分探針（probe）

是指經過特殊標記的已知序列核苷酸片段，可以用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA片段。

探針的種類

寡核苷酸基因組DNAcDNA片段

RNA片段標記物

放射性同位素生物素熒光染料

本文檔共61頁；當前第6頁；編輯于星期二\2點59分Southern印跡雜交的基本步驟待測DNA樣品的限制性內切酶消化

酶切DNA樣品的電泳分離凝膠中DNA的變性和Southern轉移

探針的制備

Southern雜交

雜交結果的檢測

本文檔共61頁；當前第7頁；編輯于星期二\2點59分M1210×SSC

轉移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜本文檔共61頁；當前第8頁；編輯于星期二\2點59分

基因組DNA的定性與定量分析。如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。重組質粒和噬菌體的分析。Southertblotting用途本文檔共61頁；當前第9頁；編輯于星期二\2點59分（二）Northern印跡雜交

利用類似于Southern印跡雜交的技術來檢測RNA稱為Northern印跡雜交（Northernblotting）。

Northern印跡雜交基本原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測的分子是RNA，可用來對組織或細胞中的mRNA進行定性或定量分析。本文檔共61頁；當前第10頁；編輯于星期二\2點59分Northern印跡雜交的基本過程本文檔共61頁；當前第11頁；編輯于星期二\2點59分相同點：名稱相對于Southernblotting轉移的是RNA轉移前無需酶切轉移效率較高變性方法不同點原理均為毛細作用本文檔共61頁；當前第12頁；編輯于星期二\2點59分Northernblotting用途

檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA

的表達水平。比較不同組織和細胞的同一基因的表達情況。本文檔共61頁；當前第13頁；編輯于星期二\2點59分二、蛋白質印跡技術(Westernblotting)

蛋白質印跡技術是根據蛋白質分子之間存在相互作用的特點，將蛋白質電泳分離，然后將其轉移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）上，再用相應的蛋白質分子對其進行檢測。最常用的蛋白質是抗體，因此被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術。

本文檔共61頁；當前第14頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第15頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第16頁；編輯于星期二\2點59分

首先將混合蛋白質用PAGE按分子大小分開，再將蛋白質轉移到NC膜上，蛋白質的位置可保持在膠中的原位上。與DNA和RNA印跡相似之處本文檔共61頁；當前第17頁；編輯于星期二\2點59分蛋白質的轉移只有靠電轉移蛋白質的檢測以抗體作探針用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶（HRP）標記第二抗體，底物顯色來檢測蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與化學發(fā)光劑結合以提高敏感度?；蛴猛凰貥擞浀诙贵w，放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。與DNA和RNA印跡不同之處本文檔共61頁；當前第18頁；編輯于星期二\2點59分Westernblotting應用

檢測樣品中的特異蛋白質的存在細胞中特異蛋白質的定量分析蛋白質分子的相互作用研究本文檔共61頁；當前第19頁；編輯于星期二\2點59分三種印跡技術的比較Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽本文檔共61頁；當前第20頁；編輯于星期二\2點59分第2節(jié)

PCR技術的原理與應用

（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈反應本文檔共61頁；當前第21頁；編輯于星期二\2點59分

PCR技術是1985年由美國科學家KaryBMullis建立的體外擴增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產率高、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點，是分子生物學技術中一項具有革命性的創(chuàng)舉。

PCR方法被美國Science雜志評為1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被評選為象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。本文檔共61頁；當前第22頁；編輯于星期二\2點59分5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、PCR技術的基本原理本文檔共61頁；當前第23頁；編輯于星期二\2點59分Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。本文檔共61頁；當前第24頁；編輯于星期二\2點59分模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分本文檔共61頁；當前第25頁；編輯于星期二\2點59分二、PCR技術的主要特點1.特異性強2.靈敏度高3.簡便快速4.對標本的純度要求低本文檔共61頁；當前第26頁；編輯于星期二\2點59分2.采用PCR方法獲得目的基因

引物選擇：特異引物、隨機引物、簡并引物

1.采用RT-PCR方法擴增目的基因三、PCR技術的主要用途（一）目的基因的擴增與克隆本文檔共61頁；當前第27頁；編輯于星期二\2點59分（二）基因的體外定點突變（三）基因突變分析（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列測定三、PCR技術的主要用途本文檔共61頁；當前第28頁；編輯于星期二\2點59分(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去DNA鏈末端合成終止法Sanger1958年和1980年兩次獲Nobel獎本文檔共61頁；當前第29頁；編輯于星期二\2點59分DNA鏈末端合成終止法本文檔共61頁；當前第30頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第31頁；編輯于星期二\2點59分DNA自動測序用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記4種ddNTP，然后進行Sanger測序反應，產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離。通過4種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

本文檔共61頁；當前第32頁；編輯于星期二\2點59分DNA自動測序結果本文檔共61頁；當前第33頁；編輯于星期二\2點59分四、幾種重要的PCR衍生技術（一）反轉錄PCR技術(RT-PCR)（二）原位PCR技術(ISP)（三）實時PCR技術(realtimePCR)本文檔共61頁；當前第34頁；編輯于星期二\2點59分RT-PCR技術AAnATTnT5′5′mRNA反轉錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶PCR擴增出大量的產物本文檔共61頁；當前第35頁；編輯于星期二\2點59分實時PCR技術原理本文檔共61頁；當前第36頁；編輯于星期二\2點59分第3節(jié)

轉基因技術

與基因剔除技術本文檔共61頁；當前第37頁；編輯于星期二\2點59分

是指將外源基因整合到動物細胞或植物細胞的基因組中并使外源基因在動物細胞或植物細胞中穩(wěn)定遺傳和表達的技術。

基因的導入方式主要：

顯微注射法胚胎干細胞法逆轉錄病毒感染法

一、轉基因技術本文檔共61頁；當前第38頁；編輯于星期二\2點59分

即體細胞克隆技術，是用顯微操作、電融合等方法將動物體細胞的細胞核全部導入另一個個體的去除細胞核的卵細胞內，使之發(fā)育成為個體。二、核轉移技術本文檔共61頁；當前第39頁；編輯于星期二\2點59分

核轉移技術可使一個細胞變成一個個體，這樣產生的個體所攜帶的遺傳物質與細胞核供體的遺傳物質完全一樣，是一種無性繁殖的過程，即克隆(clone)。本文檔共61頁；當前第40頁；編輯于星期二\2點59分通過分子生物學的方法定向地敲除動物體細胞內的某個基因的技術稱為基因剔除(geneknock-out)或基因打靶(genetargeting)。三、基因剔除技術本文檔共61頁；當前第41頁；編輯于星期二\2點59分四、基因轉移和基因剔除在醫(yī)學中的應用（一）建立疾病動物模型（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產可用于人體器官移植的動物器官本文檔共61頁；當前第42頁；編輯于星期二\2點59分第4

節(jié)

生物芯片技術本文檔共61頁；當前第43頁；編輯于星期二\2點59分DNA芯片(DNAchip)、DNA陣列(DNAarray)cDNA芯片(cDNAchip)

指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。一、基因芯片(genechip)本文檔共61頁；當前第44頁；編輯于星期二\2點59分

將探針與熒光標記的待測樣品分子進行雜交，通過檢測系統檢測雜交的熒光信號和強度，從而獲取樣品分子的數量和序列信息。

本文檔共61頁；當前第45頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第46頁；編輯于星期二\2點59分

將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質芯片(proteinchip)又稱蛋白質陣列

(proteinarray)本文檔共61頁；當前第47頁；編輯于星期二\2點59分基本原理：

蛋白質與蛋白質分子之間在空間構象上能特異性的相互識別和相互結合。如抗體與抗原或受體與配體之間的特異性結合。最常用的探針：

抗體，抗體與抗原結合的特異性最強。檢測方法：

標記檢測法、直接檢測法本文檔共61頁；當前第48頁；編輯于星期二\2點59分第5節(jié)蛋白質相互作用研究技術本文檔共61頁；當前第49頁；編輯于星期二\2點59分1989年美國紐約州立大學的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(yeasttwo-hybridsystem)。該系統的建立是基于對酵母轉錄因子Gal4分子的研究。轉錄激活因子DNA結合結構域(BD)(DNAbindingdomain)轉錄激活結構域(AD)(activationdomain)一、酵母雙雜交系統（一）酵母雙雜交系統的基本原理N端C端本文檔共61頁；當前第50頁；編輯于星期二\2點59分

這兩個結構域各具功能，互不影響,單獨存在時沒有轉錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結構方可表現出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。本文檔共61頁；當前第51頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第52頁；編輯于星期二\2點59分本文檔共61頁；當前第53頁；編輯于星期二\2點59分（二）酵母雙雜交系統的應用1.分析已知蛋白質之間的相互作用及蛋白質的功能結構域2.篩選和發(fā)現新的蛋白質3.篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

4.繪制蛋白相互作用系統圖譜本文檔共61頁；當前第54頁；編輯于星期二\2