關于熒光免疫試驗第1頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三掌握：熒光的基本知識；熒光抗體染色與結果判斷。熟悉：熒光物質。了解：熒光抗體的制備；熒光顯微鏡的基本結構；熒光免疫分析；熒光免疫技術的應用。教學目的第2頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)熒光免疫試驗的組成因素第二節(jié)間接免疫熒光試驗第三節(jié)流式熒光免疫試驗第四節(jié)其他與熒光檢測相關的免疫試驗第五節(jié)熒光免疫試驗的臨床應用第六節(jié)影響熒光免疫試驗的主要因素第3頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光免疫試驗（fluoroimmunoassay):

以熒光物質標記抗體和抗原，通過與相應抗原或抗體發(fā)生特異性結合反應，以此對待測物進行定位、定性和定量分析的檢測技術，具有高度特異性、敏感性和直觀性，是最早出現(xiàn)的免疫標記技術。第4頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三

熒光物質吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當其回復至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。第一節(jié)熒光免疫試驗的組成要素吸收能量激發(fā)態(tài)

基態(tài)熒光效率第5頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光特點：

1可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；2一旦停止供能，熒光隨之瞬間消失；第6頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三(一)熒光的基本知識1.發(fā)射光譜:指固定激發(fā)光波長，在不同波長下記錄到的標本發(fā)射熒光的譜圖。2.激發(fā)光譜:指固定檢測發(fā)射光波長，用不同波長的激發(fā)光照射標品得到的熒光的譜圖。

一熒光及熒光物質基礎知識第7頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光效率

＝吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）熒光色素本身的物理特性激發(fā)光強度及激發(fā)光波長決定于決定于3.熒光物質將吸收的光能轉變成熒光的百分率------熒光效率第8頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三定義:熒光物質被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。各種熒光物質的熒光壽命不同。

4.熒光壽命第9頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三5.熒光淬滅:熒光物質在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。如紫外線照射、高溫（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。第10頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三如何避免：勿長時間照射脈沖瞬間照射避光保存猝滅劑：具有熒光猝滅作用的物質熒光淬滅

第11頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光物質最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定（二）熒光物質第12頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光顯微鏡

利用一定波長的激發(fā)光對待測標本進行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對組織細胞結構或其組分進行定性、定位和半定量分析檢測。

二、熒光顯微鏡第13頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三隔熱濾光片：位于燈室聚光器前，作用阻斷紅外線通過而隔熱。激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，作用能選擇性地透過紫外線可見波長的光域，提供合適的激發(fā)光。

吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，作用阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過，保護眼睛。熒光顯微鏡濾光片第14頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三透射光：照明光線從標本下經(jīng)聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經(jīng)垂直照明器落射到標本，經(jīng)標本反射進入物鏡。透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)熒光顯微鏡光路第15頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第16頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第17頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三1、抗體要求

高特異性高親和力經(jīng)純化提取IgG

三、熒光素-抗體結合物第18頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三有能與蛋白質形成共價健的化學基團熒光效率高，熒光色澤與背景組織的色澤對比度高。與蛋白質結合后不影響蛋白質原有性質。標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。2熒光素要求第19頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三一、基本原理特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結合。

間接熒光抗體染色法示意圖

第二節(jié)間接免疫熒光試驗第20頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三間接免疫熒光法示意圖第21頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第22頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三間接法：

優(yōu)點：敏感度高于直接法制備一種熒光抗體可檢測多種抗原既可用于檢測抗原，也可檢測抗體缺點：易出現(xiàn)非特異性熒光方法較麻煩操作時間較長應用：自身抗體的檢測第23頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三標本片上滴加特異性抗體37℃30minPBS洗滌滴加二抗

37℃30minPBS洗滌鏡檢二、實驗方法第24頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三三、注意事項1.熒光染色時間：一小時內或2~8℃保存4小時，2.三種對照：①陽對：陽性血清+熒光標記物②陰對：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.標本片需保持濕潤，避免干燥4.滴加抗體或熒光標記物,始終保持在未知抗原標本上第25頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三

-：無或僅見極微弱熒光。

+：熒光較弱但清楚可見。

++：熒光明亮。

+++：耀眼強熒光。特異熒光強度+以上判定為陽性，對照光應呈-或±。根據(jù)+的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價。

熒光抗體染色及結果判斷第26頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)流式熒光免疫試驗流式熒光免疫試驗(flowcytometryandfluorescenceimmunoassay):采用人工微球和流式檢測方式對可溶性物質進行高通量分析的檢測方法。懸浮陣列；流式微球陣列第27頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三

第四節(jié)

其他與熒光檢測相關的免疫試驗第28頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三其他熒光免疫試驗時間分辨熒光免疫測定熒光酶免疫測定熒光偏振免疫測定第29頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光（一）基本原理時間分辨檢測原理示意圖1.時間分辨一、時間分辨熒光免疫測定第30頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三2.stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差。

stokes位移小，相互干擾，影響結果準確性。鑭系元素Stokes位移大(273nm)，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不重疊時間分辨熒光免疫測定第31頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三發(fā)射光譜帶較窄：613nm±10nm，干擾少激發(fā)光譜帶較寬：300nm～350nm，靈敏度高3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜時間分辨熒光免疫測定第32頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三4.熒光標記物的相對比活性比活性：單位時間內每個標記分子可被探測到的信號量。Eu3+螯合物反復激發(fā)1000次/秒大大提高了熒光標記物比活性時間分辨熒光免疫測定第33頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三結合β-二酮體Eu3+解離酸性增強液熒光增強Eu3+標記抗原抗體復合物5.信號增強時間分辨熒光免疫測定第34頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三（二）標記物和標記方法時間分辨熒光免疫測定第35頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三（三）方法類型

雙抗體夾心法固相抗體競爭法固相抗原競爭法時間分辨熒光免疫測定第36頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三（三）方法類型時間分辨熒光免疫測定（雙抗體夾心法）示意圖第37頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L分析范圍寬：4～5個數(shù)量級標記物穩(wěn)定：有效使用期長測量快速，易自動化易受污染，本底增高方法評價時間分辨熒光免疫測定第38頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三光線通過偏振濾光片后，形成一個方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(綠光,525nm～550nm)偏振光(藍光,485nm)熒光物質二、熒光偏振免疫測定第39頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三

抗原抗體競爭反應AgF分子小，轉動速度快，偏振熒光弱

AgF-Ab分子大，轉動速度慢，偏振熒光強若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強度成反比熒光偏振免疫測定原理示意圖基本原理第40頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三方法評價

樣品用量少熒光素標記試劑穩(wěn)定，使用壽命長重復性好快速，易自動化適于小、中等分子物質檢測靈敏度較非均相熒光免疫測定法低熒光偏振免疫測定第41頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三

第五節(jié)熒光免疫試驗的臨床應用

第42頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三1.血清中自身抗體檢測抗核抗體(均質型)抗核抗體(核膜型)抗核抗體(斑點型)一、間接免疫熒光試驗第43頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三2.各種微生物的快速檢查和鑒定寄生蟲（猴胚腎細胞內弓形蟲）細菌（藤黃微球菌)一、間接免疫熒光試驗第44頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三腫瘤（人肝癌細胞）間接免疫熒光試驗3、寄生蟲感染的診斷4、白細胞分化抗原的檢測5、人類白細胞抗原的檢測6、腫瘤組織中腫瘤標志物的檢測7、激素和酶的組織定位第45頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三（一）時間分辨熒光免疫試驗二、其他熒光免疫試驗1.內分泌學中的應用2.腫瘤學中的應用3.免疫學中的應用4.分子生物學的應用5.微生物學中的應用（二）熒光偏振免疫試驗第46頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三第六節(jié)、影響熒光免疫試驗的主要因素一、熒光素-抗體結合物二、待檢標本三、其他第47頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光素-抗體結合物的結合比率：

F/P=一、熒光素-抗體結合物抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體純度：高親和力、單克隆抗體抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗第48頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三熒光素與蛋白質結合的比率（F/P）------熒光素結合到抗體蛋白上的量是標記抗體質量鑒定的重要指標F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多第49頁，講稿共53頁，2023年5月2日，星期三組織標本：冷凍切片、石蠟切片和