蛋白質(zhì)藥物新劑型研究

武漢大學(xué)藥學(xué)院李勇蛋白質(zhì)藥物

蛋白質(zhì)藥物可分為多肽和基因工程藥物、單克隆抗體和基因工程抗體、重組疫苗；與以往的小分子藥物相比，蛋白質(zhì)藥物具有高活性、低毒性、特異性強(qiáng)、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。多肽類藥物傳統(tǒng)的主要是多肽類激素,近年來發(fā)展到各個(gè)領(lǐng)域:

抗腫瘤多肽

抗病毒多肽

抗菌活性肽

多肽疫苗

診斷用多肽

細(xì)胞因子模擬肽心血管疾病的多肽多肽類藥物品種

產(chǎn)品名稱主要作用重組表皮生長(zhǎng)因子燒傷重組胰島素糖尿病生長(zhǎng)抑素診斷胰島素瘤,治療糖尿病、生長(zhǎng)激素多水蛭素血纖蛋白溶解胰島素樣生長(zhǎng)因子傷口愈合降鈣素骨骼病縮宮素引產(chǎn)心房肽急性阻塞性心臟病谷胱甘肽抗氧化、抗衰老促黃體生成素增加精子量,增強(qiáng)精子活性,減少畸形精蛋白質(zhì)藥物的研究歷程1982年美國(guó)Likky公司首先將重組胰島素投放市場(chǎng)，標(biāo)志著第一個(gè)重組蛋白質(zhì)藥物的誕生。20多年來，蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。全球生物技術(shù)公司總數(shù)已近5000家，上市公司有600余家，銷售總額近400億美元，其中蛋白質(zhì)藥物占總銷售額的70%。從整個(gè)產(chǎn)業(yè)的分布情況看，主要集中在歐美，占全球總數(shù)的85%，歐美公司的銷售額占全球生物技術(shù)公司銷售額的97%。

蛋白質(zhì)藥物市場(chǎng)

目前已批準(zhǔn)近150個(gè)蛋白質(zhì)藥物上市，適應(yīng)癥達(dá)220種，使3.25億患者受益.如紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(EPO)，從1989年投入市場(chǎng)以后，已經(jīng)為開發(fā)商Amgen公司帶來了超過100億美元的利潤(rùn)，其2003年銷售額達(dá)33億美元，使得Amgen一躍成為全美最大的生物工程公司。更重要的是目前還有近400種蛋白質(zhì)藥物處于臨床研究階段，約3000種處于臨床前研究階段；預(yù)計(jì)到2025年，美國(guó)生物技術(shù)市場(chǎng)總額將達(dá)到2萬億美元。

蛋白質(zhì)藥物新劑型新劑型的主要方向:埋植劑微球注射劑肺部途徑口服途徑鼻黏膜途徑透皮途徑蛋白質(zhì)藥物的PEG修飾PEG是一種親水、不帶電荷的線性大分子,當(dāng)它與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價(jià)結(jié)合時(shí),可作為一種屏障遮擋住蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇,避免抗體的產(chǎn)生,或者阻止抗原與抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生。此外,蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾后,Mr增加,腎小球的濾過減少,而且PEG的屏障作用還保護(hù)了蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解,這些均有助于蛋白質(zhì)、多肽類藥物循環(huán)半衰期的延長(zhǎng)。蛋白質(zhì)藥物的PEG修飾實(shí)例姚文兵等以PEG25000的衍生物單甲氧基PEG(mPEG)對(duì)重組人干擾素α22b(rhIFNα22b)進(jìn)行了修飾研究,結(jié)果修飾后的rhIFNα22b熱穩(wěn)定性、耐酸、堿穩(wěn)定性都有極大地提高,體內(nèi)半衰期也明顯延長(zhǎng)。Roche公司的PEGASYS(PEG2IFNα22a)相繼上市。將高分子量的PEG特異性連接在IFNα22a分子上,每周只需注射1次,是藥物治療丙肝的突破性進(jìn)展。埋植劑(implant)細(xì)棒型埋植劑埋植劑外形為一空心微型細(xì)棒，一頭封閉，另一頭開口，棒材為聚四氟乙烯等非生物降解聚合物。腔內(nèi)灌入藥物與硅膠混合物。埋植劑埋入人體皮下，藥物通過硅膠基質(zhì)開口處緩慢釋放。美國(guó)內(nèi)科醫(yī)生手冊(cè)上收載了商品名為Norplant的埋植劑，藥物為左旋-18乙基炔諾酮，用于計(jì)劃生育。該制劑每根直徑2.4

mm，長(zhǎng)34

mm，醫(yī)生通過手術(shù)將6根細(xì)棒狀物埋植在患者上臂內(nèi)側(cè)，藥物可在體內(nèi)按零級(jí)模式釋藥達(dá)5年，藥物釋完后再經(jīng)手術(shù)取出。

埋植劑(implant)微型滲透泵埋植劑美國(guó)Alza公司20世紀(jì)70年代開發(fā)了外形像膠囊的埋植劑，該制劑埋植于皮下或其它部分，體液可滲透過外殼，溶解夾層電解層，使體積膨脹的夾層壓向塑性內(nèi)腔，促使藥物溶液從開口定速釋放。有不少生物大分子藥物，如胰島素、肝素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等作為模型藥物的動(dòng)物體內(nèi)外研究報(bào)道。埋植劑對(duì)長(zhǎng)期用藥的慢性患者治療具有積極意義，但它存在以下缺陷：①必須經(jīng)手術(shù)途徑植入。②制劑骨架材料為非生物降解聚合物，還需經(jīng)手術(shù)取出。③制劑在局部組織有刺激與不適感。

可注射的埋植劑可注射的埋植劑

可生物降解聚合物作為埋植型或注射型緩釋制劑骨架是近20年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者大力研究的方向，這類聚合物包括兩大類：①天然聚合物，如明膠、葡聚糖、白蛋白、甲殼素等。②合成聚合物，如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸-羥乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚己內(nèi)酯、聚羥丁酸等。聚乳酸-羥乙酸PLGAPLGA于20世紀(jì)70年代起即用作外科縫線及體內(nèi)埋植材料，如人工關(guān)節(jié)、護(hù)板、螺栓等。聚合物在體內(nèi)可逐漸降解為乳酸、羥乙酸，后者經(jīng)三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳。具有良好的生物相容性(biocomparability)、無免疫反應(yīng)、安全高、理化性質(zhì)穩(wěn)定可通過改變兩單體比例及聚合條件調(diào)節(jié)聚合物在體內(nèi)的降解速度。

可降解埋植劑近年Zenica公司Zoladex的可注射埋植劑，將多肽藥物戈舍瑞林(goserelin)與PLGA在熔融狀態(tài)混勻后經(jīng)一多孔裝置擠出，擠出物直徑為1

mm，單劑量3.6

mg，滅菌后直接密封于一次性注射器內(nèi)待用該制劑可直接注射于皮下或肌內(nèi)，在體內(nèi)可逐漸降解，徹底改變了以往埋植劑必須經(jīng)手術(shù)途徑植入、取出的局面。

但可降解埋植劑也有自身缺陷：酸性降解產(chǎn)物(乳酸、羥乙酸)在埋植劑內(nèi)部逐漸蓄積，多肽、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可能會(huì)受影響，故近來研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向注射微球蛋白質(zhì)藥物微球注射劑微球注射劑采用生物可降解聚合物，如PLGA為骨架材料，包裹多肽、蛋白質(zhì)藥物制成。LHRH類似物微球是研究最為成功的品種。

LHRH為10個(gè)氨基酸組成的小分子多肽。分子結(jié)構(gòu)為：焦谷1-組2-色3-絲4-酪5-甘6-亮7-精8-脯9-甘10-NH2?？刂菩约に氐暮铣膳c分泌，調(diào)節(jié)性器官的生長(zhǎng)發(fā)育。微球注射劑實(shí)例曲普瑞林(triptorelin)是LHRH類似物之一，其PLGA微球由法國(guó)Ipsen公司開發(fā)，1986年上市，可緩釋1個(gè)月，是第一個(gè)多肽微球產(chǎn)品。

亮丙瑞林(leuprorelin)生物活性為L(zhǎng)HRH的15倍。由日本武田化學(xué)制藥公司開發(fā)，于1989年進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，隨后有多種LHRH類似物緩釋微球注射劑上市。

丙氨瑞林(LHRH-A)是上海麗珠-東風(fēng)生物技術(shù)有限公司開發(fā)的國(guó)家一類新藥，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院承擔(dān)國(guó)家科委“九五”攻關(guān)項(xiàng)目，動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)證明其緩釋效果可靠。研究中的蛋白質(zhì)藥物微球注射劑

適應(yīng)證

劑型骨架

促紅細(xì)胞生成

腎功能不全PLGA

γ-干擾素

肉芽瘤

微球

PLGA

白介素(IL-α)

腫瘤免疫

PLGA人粒細(xì)胞巨噬細(xì)

骨髓移植

PLGA

人生長(zhǎng)激素

生長(zhǎng)不良

PLGA

生長(zhǎng)抑素

生長(zhǎng)激素分泌亢進(jìn)

PLGA

微球的制備方法

復(fù)乳-液中干燥法(w/o/w

-liquid

drying

process)

將生物可降解聚合物，如PLGA溶解在有機(jī)溶媒中，水相中加入定量的多肽成溶液或混懸液。將水相加入上述有機(jī)相中，勻化超聲成初乳(w/o)，初乳再轉(zhuǎn)入含PVA的水溶液中，攪拌成復(fù)乳(w/o/w)，升高系統(tǒng)溫度，除去有機(jī)溶媒，固液分離后，干燥待用。

低溫噴霧提取法(cryogenic

process)

將多肽及其穩(wěn)定劑的粉末或凍干品和生物可降解聚合物的二氯甲烷溶液均勻混合，混懸液經(jīng)一噴頭以霧狀噴至冰凍的乙醇溶液中，后者界面封以液氮。在-70℃溫度下，乙醇將微球中二氯甲烷不斷抽提，經(jīng)過濾去除乙醇，得流動(dòng)性佳的微球，干燥待用。

微球的制備方法比較

復(fù)乳法是目前制備多肽微球最常用的方法，它具有工藝穩(wěn)定、設(shè)備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。比較復(fù)乳法與低溫噴霧法，前者制備的微球突釋效應(yīng)常達(dá)15%～35%，而用低溫噴霧法制備的微球可明顯改善上述缺點(diǎn)，而且據(jù)報(bào)道藥物包裹率可達(dá)100%。

微球的突釋效應(yīng)是此劑型存在的難題，它除與載體特性有關(guān)外，工藝也是重要的影響因素，本文介紹的復(fù)乳-液中干燥法與低溫噴霧法是較有應(yīng)用價(jià)值的工藝肺部吸入系統(tǒng)人肺的吸附表面積有140m2，血流迅速，蛋白酶活性相對(duì)于胃腸道較低，不存在肝臟首過效應(yīng)。肺泡壁比毛細(xì)血管壁還要薄，通透性好。一些多肽藥物經(jīng)肺給藥后生物利用度相當(dāng)高，可達(dá)20%～50%。肺部吸入系統(tǒng)應(yīng)用現(xiàn)狀如Inhale的吸入胰島素在1997年進(jìn)入臨床。1998年9月21日公開了其II期臨床取得的很好的治療效果。2003年6月宣稱III期臨床取得滿意結(jié)果。除胰島素外，研究的肺部吸入藥物還有降鈣素、LHRH、白介素、胰高血糖素、甲狀旁腺激素、重組人脫氧核糖核酸酶、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子等。肺部吸入系統(tǒng)裝置。合適的給藥裝置將藥物輸送至肺泡組織是關(guān)鍵，粉霧劑將是肺部吸入的主要?jiǎng)┬?。理想的粉霧劑應(yīng)是：粉末處方組分在低流速和低壓力差時(shí)，大部分藥物粒子能夠解聚，進(jìn)入粉霧氣流中；吸入裝置則易產(chǎn)生流速較高的湍流。干粉吸入避免了溶液劑中藥物的降解，微粉化技術(shù)保證了藥物不在氣管或支氣管滯留，順利進(jìn)入肺部組織。粉霧劑處方目標(biāo)（1）為了使制成的粉末既有良好流動(dòng)性，便于填充、分裝和分散，需要制備較大的粒子；（2）為了能夠形成的足夠細(xì)小的粒子以透過口咽部及上呼吸道并沉降在肺部，需要制備氣流動(dòng)力學(xué)直徑在1～6微米之間的細(xì)粒子。所以需要在考慮處方及工藝時(shí)達(dá)到以上相互矛盾的目標(biāo)。粉霧劑處方方案一種方案是將活性藥物的微粉粒子與賦形劑載體大粒子混合。在施加吸氣氣流藥物即分離成為合格的可吸入粉末，而系統(tǒng)中所用的載體大粒子，通常直徑為30～100微米，則大部分沉降在口、咽部，只有少量到達(dá)肺部。另一種技術(shù)是，將藥物微粉顆?；⑹怪蔀樗缮⒌膱F(tuán)塊，當(dāng)施以空氣剪切力時(shí)即可破碎成為可吸入的粉霧。目前較新的方法是制備粒徑大但絕對(duì)密度低的顆粒。這種顆粒大小可以滿足粉末流動(dòng)及分裝的要求，同時(shí)在被氣流分散時(shí)有適宜的氣流動(dòng)力學(xué)直徑?？诜o藥蛋白質(zhì)、多肽類藥物直接口服給藥的最大障礙是其吸收率很低。經(jīng)過大量研究,蛋白質(zhì)、多肽類藥物已經(jīng)可以借助特殊載體系統(tǒng)進(jìn)行遞送,如通過乳劑、脂質(zhì)體、微囊、微球、納米粒等載體系統(tǒng),可有效地從胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)。另外,通過一定的制劑工藝和高分子材料選擇、修飾、改性,再佐之以酶抑制劑、吸收促進(jìn)劑,可顯著提高生物利用度。聚合物微粒Damge等[8]用吸附法制備了胰島素聚氰基丙烯酸酯(polyakylcyanoacry2late,PACA)微粒。由于在強(qiáng)酸性條件下,胰島素和PACA微粒之間存在強(qiáng)烈的靜電吸引作用,因此胰島素分子可牢固吸附于微粒表面。體外研究表明,胰島素吸附于聚合物微粒表面后,胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶對(duì)其的降解作用顯著降低,微粒表現(xiàn)出良好的保護(hù)胰島素活性的作用微乳微乳是粒徑為10～100nm的乳滴分散在另一種液體中形成的膠體分散系統(tǒng),外觀上為透明液體。

微乳口服給藥最大的優(yōu)點(diǎn)在于提高蛋白質(zhì)、多肽類藥物的穩(wěn)定性,藥物經(jīng)淋巴管吸收從而克服了首過效應(yīng)以及大分子通過胃腸道上皮細(xì)胞膜時(shí)的障礙。其滲透力強(qiáng)并可根據(jù)分散相的量及環(huán)境溫度(如體溫)的改變而轉(zhuǎn)相,從而使藥物自微乳中釋放黏膜黏附給藥系統(tǒng)常用的生物黏附材料有生物凝集素類結(jié)合物(如番茄凝集素)、糖接枝聚合物、硫化聚合物等。Elan公司開發(fā)了促進(jìn)藥物口服吸收的生物溶蝕系統(tǒng)。將大分子藥物和生物降解材料的骨架做成亞微米級(jí)的粒子,進(jìn)一步修飾可以達(dá)到靶向及提高藥物的口服生物利用度的目的;藥物局部吸收系統(tǒng)把對(duì)胃腸道上皮細(xì)胞具有靶向作用的配體,黏附在蛋白質(zhì)、多肽類藥物微囊上,避免了藥物口服后在胃腸道中的損失,并能在特定部位釋藥。結(jié)腸靶向以結(jié)腸中特有的菌群和多糖降解酶為觸發(fā)機(jī)制的給藥系統(tǒng),克服了pH依賴型和時(shí)滯型的不確定性,顯示出高度的靶向性,具有良好的應(yīng)用前景。將結(jié)腸靶向和黏膜黏附技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)了結(jié)腸靶向黏附釋藥系統(tǒng)。該遞送系統(tǒng)把藥物運(yùn)送到結(jié)腸部位,釋放出含藥微粒,使含藥微粒在一定時(shí)間內(nèi)黏附在結(jié)腸黏膜表面,藥物直接擴(kuò)散到結(jié)腸黏膜細(xì)胞而被吸收。

殼聚糖(chitosan)作為一種優(yōu)良的天然材料,既能被黏膜上高濃度的溶菌酶和結(jié)腸微生物產(chǎn)生的酶所特異性降解,又具有良好的生物黏附性,是目前研究較多的一種蛋白質(zhì)、多肽類藥物載體材料。鼻腔給藥系統(tǒng)

該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是吸收面積大,上皮細(xì)胞間隙大，血管和淋巴管豐富，血流交換速度快，首過破壞限制少。其給藥的缺點(diǎn)是鼻腔纖毛的節(jié)律運(yùn)動(dòng)對(duì)藥物的排除；鼻腔蛋白水解酶的降解；長(zhǎng)期用藥對(duì)鼻纖毛的毒性等。鼻腔給藥方式鼻腔給藥的方式有滴鼻給藥和噴霧給藥法，采用后者可獲得相對(duì)較高的生物利用度。粉末或微球的滯留時(shí)間長(zhǎng)，有利于藥物穩(wěn)定和吸收，但可能產(chǎn)生鼻黏膜剌激。采用吸收促進(jìn)劑和酶抑制劑等可提高多肽及蛋