第二章

動物實驗技術(shù)

隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，實驗動物學(xué)的研究也不斷深入，逐漸形成了一門獨立的綜合性學(xué)科，對動物模型的認(rèn)識逐步加深。目前，人們已經(jīng)通過模型動物發(fā)現(xiàn)了許多人類疾病的起因，為研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展、研究開發(fā)新藥和制定防治措施做出了巨大貢獻(xiàn)。神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能尤為復(fù)雜，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，因此利用動物實驗研究疾病的發(fā)生發(fā)展過程對神經(jīng)病學(xué)研究顯得特別重要。第一節(jié)實驗動物

一、動物的選擇

用于醫(yī)學(xué)實驗的動物種類很多，但哪種動物最為理想，很難界定，應(yīng)根據(jù)實驗要求和條件而定。一般來說，理想的實驗動物應(yīng)具備以下基本條件。

1、動物的種屬與人類接近

動物實驗的目的是利用實驗動物所得的數(shù)據(jù)和資料，來推測和判斷人類的有關(guān)數(shù)據(jù)和資料。從遺傳學(xué)角度講，動物的種屬愈接近人類，所得的實驗數(shù)據(jù)實用價值就愈大。據(jù)此而論，哺乳動物中與人類最接近的靈長類動物（猴、狒狒、猩猩）是最理想的實驗動物。但目前靈長類動物來源很少，飼養(yǎng)條件較高、價格昂貴，因而不宜作為首選的實驗動物。

2、動物的解剖生理特點與人類接近

除靈長類動物外，其他哺乳類動物在解剖和生理特征上與人類最為接近。目前，醫(yī)學(xué)生物學(xué)實驗中通常應(yīng)用的哺乳類動物有鼠、兔、狗、貓、小型豬、羊等。

3、種系較純

不同種系的動物存在著較大的差異，而種系較純動物個體間差異較小，所得實驗數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上系統(tǒng)誤差較小。目前，國內(nèi)較大的實驗動物中心所提供的大鼠、小鼠、沙土鼠、兔等均為純系動物，如Wistar大鼠、SD大鼠、新西蘭兔等。

4、易于繁殖、飼養(yǎng)

動物的繁殖和飼養(yǎng)條件的高低對實驗也有重要的影響，用于慢性實驗的動物需要存活較長的時間，如動物的繁殖和飼養(yǎng)條件要求太高，動物不易存活，必將影響實驗的正常進(jìn)展。這不僅大大提高了整個實驗的費用，而且影響實驗的結(jié)果。所以，應(yīng)選擇繁殖和飼養(yǎng)條件的較低的實驗動物，如鼠，兔等。

5、價格低廉

由于科研費用較為緊張，在選擇實驗動物時，動物的價格也是一個重要的因素。綜合以上原則，在醫(yī)學(xué)實驗研究中，目前以大鼠、小鼠、兔、狗、猴等是較為理想實驗動物。以下主要以普通實驗中最常用的鼠和兔為例進(jìn)行介紹。

二、動物的分組

隨機(jī)化（randomization）原則是提高組間均衡性的重要手段，也是資料統(tǒng)計分析時進(jìn)行統(tǒng)計推斷的前提。所謂隨機(jī)化是包含每個實驗單元分配于各組的機(jī)會相等，以消除非處理因素對實驗指標(biāo)的影響，控制誤差。常用方法抽簽、隨機(jī)數(shù)字表、隨機(jī)排列表以及計算機(jī)偽隨機(jī)數(shù)發(fā)生函數(shù)等。

三、動物的標(biāo)記

動物實驗中，必須對實驗動物進(jìn)行編號和標(biāo)記，以觀察每個動物的情況。標(biāo)記方法應(yīng)保證標(biāo)號清晰、易認(rèn)、牢固、適用，常用掛牌法、烙印法、耳孔法、剪指法和染色法編號標(biāo)記。其中染色法最常用。

五、動物的保定

正確地保定動物可以減少動物因應(yīng)激對實驗指標(biāo)造成的不良影響。

（一）清醒保定

在給動物灌胃、注射、采血時，需要將其保定。大鼠和小鼠可用右手捏住鼠尾向后牽拉，左手拇指和食指迅速、準(zhǔn)確地捏緊鼠雙耳背面的皮膚，手掌和其余手指將鼠體壓于實驗臺面，然后將其軀體夾于手中，進(jìn)行保定，也可用鐵絲籠捕捉大鼠進(jìn)行捕捉。

兔性情溫順，用一手抓住其頸后和背部皮膚，向上提起全身，另一手托住其臀部，不要粗暴地抓提雙耳和腹部，以免損傷耳部血管和腹部臟器。犬和猴等較大的動物，需要借助鉗式長夾和網(wǎng)罩進(jìn)行捕捉。

（二）麻醉保定

1．全身麻醉是動物實驗最常用的麻醉保定方法。

（1）吸入麻醉：吸入麻醉劑包括乙醚、氟烷、異氟烷、甲氧氟烷、氧化亞氮等。

（2）注射麻醉：一般鼠采用腹腔注射麻醉，兔采用耳緣靜脈注射或腹腔注射麻醉。常用麻醉劑有巴比妥類、水合氯醛、烏拉坦、氯胺酮等。目前大多數(shù)實驗室使用水合氯醛。水合氯醛麻醉后常有肌肉緊張，宜與烏拉坦合用。氯胺酮多用于誘導(dǎo)麻醉。

2．局部麻醉包括表面麻醉、浸潤麻醉、區(qū)域阻滯麻醉和神經(jīng)干阻滯麻醉等。

3．椎管內(nèi)麻醉包括硬膜外腔麻醉、蛛網(wǎng)膜下腔麻醉和骶管麻醉等。

六、動物的急救實驗過程中，因麻醉過量、失血過多、過度損傷、窒息等原因，動物出現(xiàn)血壓急劇下降、呼吸停止、角膜反射消失等臨床死亡癥狀，是很常見的。對于來源充足、價格便宜、數(shù)量較多的動物，可以直接處死，以免影響實驗結(jié)果。但對于價格昂貴、來源有限或?qū)嶒災(zāi)┢趦r值較大的動物，應(yīng)立即進(jìn)行急救。急救原則應(yīng)根據(jù)具體原因，采取相應(yīng)的措施：1．針刺和電刺激2．強(qiáng)心劑3．呼吸興奮劑4．動脈輸血或輸液5．人工呼吸

七、動物的處理實驗結(jié)束后，動物的處理要遵循人道主義的原則，在不影響實驗結(jié)果的前提下，盡量減少動物的痛苦。鼠和兔等小動物可通過物理致死法（頸椎脫臼法、小木錘打擊法、空氣栓塞法等）和化學(xué)致死法（深麻醉法）處死，犬、豬和猴等大動物可通過空氣栓塞法、急性失血法和化學(xué)深麻醉法處死。動物尸體要妥善處理，如集中焚燒或深埋處理。第二節(jié)實驗動物的給藥途徑

在藥理和毒理學(xué)以及臨床實驗研究中，需要給動物一定劑量的藥物以觀察藥物的療效、毒性、最佳劑量和最佳給藥時間等。但動物不可能像人那樣根據(jù)醫(yī)囑按時服藥或接受護(hù)士的注射給藥。因此，在具體實驗中，應(yīng)根據(jù)實驗的目的、藥物的理化性質(zhì)、劑型、劑量、動物的種類，選擇合適的給藥途徑。

一、經(jīng)口給藥法1．自動口服給藥可將藥物按所需要的比例均勻地?fù)饺氤Ｒ?guī)飼料中或加入一定的賦形劑后，壓制成塊狀飼料，根據(jù)實驗要求定量飼養(yǎng)。該法簡單易行，但因動物的食量不等、且飼養(yǎng)過程中能浪費數(shù)量不等的飼料，因而每只動物的給藥劑量不能精確控制。

2．強(qiáng)制灌胃給藥灌胃給藥一般多用于大鼠或小鼠，首先需將所給藥物制成液體狀態(tài)，然后用灌胃器將預(yù)先準(zhǔn)備好的藥物按實驗要求進(jìn)行灌胃。常用灌胃劑量為，小鼠0.2~0.5ml，大鼠1~2ml。兔、貓、犬等動物也可灌胃給藥。

二、注射給藥法注射給藥是最常用的給藥方法，可以精確地控制給藥劑量。有靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、椎管內(nèi)注射、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射、淋巴腔內(nèi)注射以及腦室注射等。

1．靜脈注射（1）兔：兔耳緣靜脈較粗，位于兔耳外緣的皮下，易于尋找辨認(rèn)，同一部位可反復(fù)應(yīng)用，是兔給藥的最好途徑。（2）鼠：鼠尾靜脈有三條，左右兩側(cè)和背側(cè)各一條，可以清晰辨認(rèn)。但因靜脈太細(xì)，易損傷，尤其是某些抗腫瘤和刺激性強(qiáng)的藥物，同一部位不宜反復(fù)注射。如反復(fù)注射，應(yīng)先從末端開始。（3）犬：犬的前肢頭靜脈、后肢小隱靜脈、股靜脈均可作為靜脈注射的部位。

2．腹腔注射鼠腹腔大網(wǎng)膜血液循環(huán)豐富，對藥物吸收快而完全，因而腹腔注射是鼠最常用的給藥方法。

3．肌肉注射肌肉注射應(yīng)選用肌肉發(fā)達(dá)、無大血管通過的臀部或大腿外側(cè)的肌肉。

4．皮下注射皮下注射部位，一般犬、貓選擇在大腿外側(cè)，豚鼠在后腿內(nèi)側(cè)或腹部，鼠在頸背部或側(cè)下腹部，兔在背部或耳根部。

5．皮內(nèi)注射用TB注射器緊貼表皮刺入皮內(nèi)注射藥液。

6．腦內(nèi)注射利用立體定位儀進(jìn)行精確定位，然后通過微量注射器緩慢注射

三、人與動物給藥劑量的換算由于人與動物對同一藥物的耐受性相差很大，動物的耐受性比人大，因此在用藥時必須將人的用藥劑量換算成動物的用藥劑量。由于根據(jù)體表面積進(jìn)行換算較為麻煩，具體實驗中通常按以下比例換算。如以人單位體重的用藥量為1，則小鼠、大鼠為25~50，兔、豚鼠為15~20，犬、貓為5~10。給藥途徑不同劑量也不同。以口服（灌胃）劑量為100，則灌腸劑量為100~200，皮下注射為30~50，肌肉注射為25~30，靜脈注射為25。腦室注射可進(jìn)一步減量。第三節(jié)實驗動物的生命體征

動物實驗過程中，經(jīng)常需要在保證動物繼續(xù)存活的前提下檢測動物呼吸（R）、體溫（T）、心率（P）和血壓（BP）等的生命體征，作為重要的實驗觀察指標(biāo)。一般而言，呼吸和心率只要通過密切觀察就可以得到比較精確的結(jié)果；體溫常用普通溫度計檢測肛溫或用數(shù)字溫度計檢測；血壓的測定較為困難，對于大鼠，通常用鼠尾血壓計來檢測。一、大鼠血壓的檢測

RBP-1型大鼠血壓計（bloodpressuremeterforratmodel，RBP-1）是一種無創(chuàng)性大鼠血壓心率測量儀，由滑動式大鼠固定器、網(wǎng)套及卡板、鼠尾袖帶、光電容積脈搏波傳感器、心率數(shù)字顯示器等部件組成。采用鼠尾袖帶加壓阻斷法測量大鼠的血壓，以鼠尾光電容積脈搏波隨袖帶壓力下降而重新出現(xiàn)作為收縮壓的檢測信號，配以高增益低噪音放大器，以聲、光顯示容積脈搏波，使血壓檢測信號的識別靈敏度提高，保證了儀器的測量準(zhǔn)確性。測壓時光電容積脈搏波傳感器處于封閉狀態(tài)，抗干擾能力強(qiáng)。

二、大鼠體溫的檢測

1．普通溫度計測量牢固保定或麻醉后固定大鼠，將肛管內(nèi)糞便擠出，用普通溫度計經(jīng)肛門輕輕插入肛管約1.5~2cm，以溫度計尖端的水銀部分全部插入為宜。測量2~3min至溫度計水銀柱不再上升為止，即為大鼠肛溫。2．?dāng)?shù)字溫度計測量觀察溫度對動物功能的影響時，需要精確、連續(xù)測量動物的體溫，一般采用數(shù)字溫度計進(jìn)行測量。數(shù)字溫度計由熱敏傳感探頭（或探針）和液晶顯示屏組成，可以精確測量動物的皮溫、肛溫、皮下及腹腔內(nèi)溫度等。使用時首先校正溫度計0點。然后將熱敏探頭置于待測部位，注意保持平穩(wěn)，待顯示屏數(shù)字穩(wěn)定不變時即為所測溫度

一、血液標(biāo)本

1.經(jīng)靜脈采血法兔耳緣靜脈是兔最常用的采血部位，可以反復(fù)在同一部位采血，一次采血可達(dá)5~10ml，但一次采血量不宜超過5ml，否則會因采血緩慢、時間過長，抽出的血液自行凝固而使采血失敗。鼠尾靜脈是鼠常用的采血部位，但采血量通常少于0.5ml，只能用于微量血樣檢測，而且同一部位不適于反復(fù)采血。鼠眼眶靜脈叢采血一般體重25g的小鼠每次可采血0.2~0.3ml，250g的大鼠每次可采血0.5~0.7ml。其他犬、貓、猴等大動物可經(jīng)肢體淺靜脈、股靜脈、頸靜脈采血。第四節(jié)實驗動物標(biāo)本采集

2．經(jīng)動脈采血在采血次數(shù)較少（1~2次）的實驗中或?qū)嶒灲Y(jié)束時，可采用摘除眼球采血法。股動脈是大動物常用的采血途徑，但不能反復(fù)采血。3．經(jīng)心臟采血經(jīng)心臟采血對動物的損傷嚴(yán)重，盡量不用。采血時進(jìn)針要“穩(wěn)、準(zhǔn)、很，一針見血”，否則動物容易因心臟驟停或心包積血死亡。4．?dāng)囝^采血上述采血方法所取血量不足或在實驗結(jié)束時可斷頭采血法。一般小鼠可采血1~2ml，大鼠6~8ml。5．標(biāo)本的保存通過上述方法血樣標(biāo)本，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康募皶r進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測，或通過離心分離血清或血漿（抗凝血），冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

二、尿液和糞便尿液和糞便可用接尿器或糞便收集器采集。手術(shù)過程中可通過導(dǎo)尿管收集尿液，實驗結(jié)束時可從膀胱直接抽取尿液，從大腸直接收集糞便。三、體液標(biāo)本動物實驗中，有時需要收集動物胸腔、腹腔和腦室內(nèi)的體液進(jìn)行檢測。由于鼠和兔等小動物的體液太少，不易采集，可以在實驗結(jié)束時，將動物處死，收集少量體液。對犬、豬和猴等大動物，可用與人體液采集相似的方法采集。體液應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康募皶r進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)的檢測，或冷凍（離心后冷凍）保存?zhèn)溆?。四、?xì)胞標(biāo)本將新鮮標(biāo)本病變區(qū)輕輕壓于載玻片上，吹干后立即浸入固定液取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆?。組織器官和骨髓穿刺液，可直接均勻涂在載玻片上，自然晾干，浸入固定液固定，取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆?。體液內(nèi)細(xì)胞較少時可離心再涂片。五、組織勻漿動物實驗（或手術(shù)取材）中，有時需要收集適量動物組織（腦、肝、腎等）做成組織勻漿，定性或定量檢測其中的某些活性物質(zhì)（酶、抗體、激素等）。要求所取組織盡可能新鮮，冷凍（或液氮冷凍）或加入適量溶劑（如PBS緩沖液）后研磨，離心取上清液冷藏備用。六、組織器官根據(jù)需要確定取材部位和數(shù)量，一般標(biāo)本的組織塊厚度以0.5cm為宜。第五節(jié)動物模型

人類疾病動物模型是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的、具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動物實驗對象和材料。使用動物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個極為重要的實驗方法和手段，有助于更方便、更有效的認(rèn)識人類疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律，從而制定有效的防治措施。目前，人們已經(jīng)通過模型動物發(fā)現(xiàn)了許多人類疾病的起因，為研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，研發(fā)新藥和制定防治措施做出了巨大貢獻(xiàn)。本節(jié)只介紹幾種常用的經(jīng)典動物模型。

一、動脈粥樣硬化模型在動物飼料中加入過量的膽固醇和脂肪，飼養(yǎng)一段時間，其主動脈和冠狀動脈內(nèi)可逐漸形成粥樣硬化斑塊。鼠、兔、豬、狗、雞、鴿等均可用來建立自發(fā)性或誘發(fā)性動脈粥樣硬化模型。用含1%~2%的高脂飼料喂養(yǎng)Gottigen系小型豬6個月，可復(fù)制出豬動脈粥樣硬化模型。給大鼠喂養(yǎng)l%~4%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86%~89%基礎(chǔ)飼料，7~10d可見動脈粥樣硬化斑塊。在普通飼料中加5%膽固醇、2%膽酸鈉、30%可可脂，喂養(yǎng)雄性C57BL/6J小鼠25周，主動脈弓和近端冠狀動脈內(nèi)可發(fā)生脂質(zhì)斑塊。1．飼料配方15%雞蛋黃粉、5%豬油、0.5%膽固醇、普通飼料79.5%。豬油加熱融化后，將膽固醇、蛋黃粉融入豬油，并加入普通飼料，攪拌均勻，壓制成塊狀飼料備用。

2．實驗方法（1）實驗前，以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，穩(wěn)定血脂水平和代謝狀態(tài)后，隨機(jī)分組。所有動物禁食、不禁水12h，稱量體重，自耳緣靜脈采血，測定基礎(chǔ)血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）含量等。

（2）用高脂飼料喂養(yǎng)3周后，改為15%雞蛋黃粉、5%豬油、80%普通飼料，不再加膽固醇，繼續(xù)喂養(yǎng)3周，至此兔動脈粥樣硬化模型建立完成。（3）第42天夜間，所有動物禁食不禁水12h，于次日晨各組動物稱定體重，自耳緣靜脈采血，測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。（4）氣體栓塞處死動物，取心臟和長3~4mm主動脈（自主動脈根部至髂總動脈分叉處），剝?nèi)ネ饽さ闹窘M織，用4%多聚甲醛固定，留作大體和病理標(biāo)本。3．評價指標(biāo)（1）TC、TG、HDL-C及LDL-C等血脂相關(guān)指標(biāo)。（2）主動脈內(nèi)膜/中膜（I/M）厚度比值：將4%多聚甲醛固定的主動脈標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，進(jìn)行圖象分析。以內(nèi)膜最厚處為中心，測量該點的內(nèi)膜及中膜的厚度。然后將動脈等距分為5點，分別測量，取平均數(shù)計算內(nèi)膜與中膜的厚度比值。（3）主動脈粥樣硬化斑塊分級標(biāo)準(zhǔn)：沿主動脈背側(cè)縱向剖開，直接用肉眼觀察粥樣斑塊形成情況，或?qū)用}上的脂肪剔除，用蘇丹Ⅲ染色后觀察，染色后粥樣斑塊呈紅色。

0級：內(nèi)膜表面光滑，無奶油色變化，即無粥樣斑塊。

0.5級：內(nèi)膜有廣泛的奶油色或乳白色變化，但無凸出表面的粥樣斑塊。1級：有明顯的奶油色凸出粥樣斑塊，但面積小于3mm2。2級：有粥樣斑塊，面積大于3mm2。3級：有大小不等的粥樣斑塊融合成片，大的斑塊可超過3mm2。4級：動脈內(nèi)膜表面幾乎全為融合的粥樣斑塊所覆蓋。為便于比較分析病變的分布，也可將主動脈分成主動脈弓、胸主動脈上段（第3~6肋）、胸主動脈下段（第6~10肋）及腹主動脈，進(jìn)行切片染色，顯微鏡觀察比較。

（4）冠狀動脈病變的分級：將用4%多聚甲醛固定的心臟橫切成3塊，每塊冷凍切片至少2片，用蘇丹Ⅲ和蘇木精染色，每張切片均觀察10個動脈斷面，并以下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。也可將左心室、右心室和室間隔三部分心肌分別固定各橫切成3塊，切片染色后檢查，并計算其有粥樣斑塊的小動脈數(shù)及其等級。0級：動脈內(nèi)膜無脂質(zhì)浸潤。

0.5級：動脈內(nèi)膜有輕度脂質(zhì)浸潤。1級：動脈內(nèi)膜粥樣斑塊占血管腔面積的1/4。2級：動脈內(nèi)膜粥樣斑塊占血管腔面積的1/2。3級：動脈內(nèi)膜粥樣斑塊占血管腔面積的1/2以上。4級：動脈內(nèi)膜粥樣斑塊幾乎堵塞整個管腔。二、高血壓模型高血壓病與遺傳、精神刺激、應(yīng)激、腎臟缺血、腎上腺皮質(zhì)的作用及鈉的作用等諸多因素有關(guān)。目前，高血壓動物模型多從不同角度模擬這些易患因素而建立，動物多選用鼠、兔、犬、貓、猴等。主要有遺傳性高血壓模型、應(yīng)激性高血壓模型、內(nèi)分泌性高血壓模型和腎動脈狹窄性（簡稱腎性）高血壓模型。

1.腎性高血壓模型(1)基本原理人腎硬化性高血壓可能是由于腎供血不足引起的。Goldblatt首先建立了犬單腎動脈狹窄性（1-KGH）和雙腎動脈狹窄性（2-KGH）高血壓模型，通過手術(shù)方式，人為造成動物腎動脈狹窄，腎血流量銳減。由于腎嚴(yán)重缺血而引起腎素分泌增加，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，導(dǎo)致全身小動脈收縮，鈉水潴留，循環(huán)血量增加，最終形成高血壓，稱為腎性高血壓。

(2)實驗方法現(xiàn)以大鼠為例介紹：成年健康Wistar或SD大鼠，體重150~160g，性別根據(jù)實驗要求而定。將動物麻醉后俯臥位固定，從脊柱旁皮膚切口，分離皮下組織腰背筋膜，切開內(nèi)斜肌筋膜，推開背長肌，暴露腎并小心地鈍性分離出一段腎動脈。選用一定直徑的銀夾或銀環(huán)套在腎動脈上造成腎動脈狹窄，如為2-KGH高血壓模型，10~12d后另一側(cè)腎動脈做同樣處理；如為1-KGH高血壓模型，則10~12d后摘除另一側(cè)腎。術(shù)后幾天血壓開始升高，1~2月后血壓升至高峰，并可長期維持下去。

2、腎外包扎性高血壓模型

（1）基本原理與腎動脈狹窄性高血壓模型相同。腎外異物包扎，在腎外形成一層纖維素性鞘膜，壓迫腎實質(zhì)，造成腎組織缺血，使腎素形成增加，血壓上升。

（2）實驗方法取120~150g大鼠，麻醉后皮膚消毒，沿脊椎中線切開皮膚，在一側(cè)季肋下1.5~2cm和距脊椎1cm處用小血管鉗分開肌肉，用兩指從腹下部將腎臟自創(chuàng)口中擠出，將腎臟與周圍組織剝離，將自制的雙層乳膠薄膜剪成“X”形，沿腎門將腎臟交叉包扎，然后在對側(cè)切開取出另一側(cè)腎，分離后切除，分別縫合肌肉和皮膚創(chuàng)口。約20天后，30%的大鼠出現(xiàn)高血壓。

3、神經(jīng)源性及應(yīng)激性高血壓動物模型

（1）基本原理長期的應(yīng)急反應(yīng)造成交感神經(jīng)系統(tǒng)張力增高和垂體-腎上腺素軸系統(tǒng)過度分泌，從而引起全身小血管收縮，最終導(dǎo)致高血壓。（2）實驗方法應(yīng)激源大約有二類。一類以心理應(yīng)激為主，為操作式條件反射，適用于較高等動物，如猴、狗。另一類有心理成分也有軀體成分應(yīng)激，大鼠應(yīng)激性高血壓模型常采用噪聲和足底電擊的復(fù)合刺激，每天上、下午各接受應(yīng)激一次，每次2h，20天左右可使大鼠形成高血壓。也可肌肉注射垂體后葉素配合電刺激，一般兔在實驗后11天、大鼠30天、狗35天即出現(xiàn)血壓升高，在實驗觀察的2~3個月內(nèi)，動物血壓會始終保持穩(wěn)定的升高狀態(tài)，而且動物死亡率很低。

4、內(nèi)分泌性高血壓（DOCA）模型（1）基本原理該模型屬鈉水潴留容積依賴性（volume-dependent）高血壓。當(dāng)動物單側(cè)腎臟摘除，大量給于高濃度鹽水和腎上腺鹽皮質(zhì)激素時，將導(dǎo)致動物體內(nèi)鈉水潴留。與此同時血管系統(tǒng)也隨之發(fā)生了強(qiáng)烈性變化，而引起持續(xù)性高血壓。即使停止應(yīng)用鹽皮質(zhì)激素，動物的高血壓、多尿、尿鈉消失現(xiàn)象也會持續(xù)下去。

（2）實驗方法除特殊要求外，多數(shù)都用大鼠進(jìn)行實驗，將大鼠麻醉后摘除其一側(cè)腎臟，然后給予飲用1%的鹽水，脫氧皮質(zhì)醇醋酸鹽（deoxycortcosteroneacetate，DOCA）皮下注射，劑量每周20~30mg/kg體重，一周內(nèi)分幾次注射或每周一次性注射。也可使用在生理鹽水中添加界面活性劑和把DOCA片劑包埋于動物皮下的方法，約經(jīng)2周，動物血壓開始上升，經(jīng)5~7周即可出現(xiàn)惡性高血壓病態(tài)。

5、鈉負(fù)荷高血壓模型

用高濃度鹽水作為日常飲水喂養(yǎng)Salt-sensitive大鼠（S-Strain）誘發(fā)高血壓，大鼠血壓會超過180mmHg。

6、自發(fā)（遺傳）性高血壓大鼠模型

1963年Okamoto和Aoki培育出具有持久性血壓升高的突變系大鼠，采用兄妹交配的方法，將血壓145~175mmHg的雄性Wistar鼠與血壓30~40mmHg的同種雌性鼠交配，其子代選擇血壓高者作近親交配，三代后，多數(shù)大鼠血壓超過180mmHg，即為自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneoushypertensiverat，SHR），1969年又建立SHR近交系，至1979年已培育到51代（F51）。該鼠自發(fā)性高血壓的變化與人類相似，是目前應(yīng)用最廣泛的高血壓模型，它可產(chǎn)生腦血栓、梗塞、出血、腎硬化、心肌梗塞和纖維化等變化。

目前在SHR的基礎(chǔ)上，將易產(chǎn)生卒中的SHR和不產(chǎn)生卒中的SHR分別以近親交配方式繁殖，培育出了易卒中自發(fā)性高血壓大鼠（SHRSP）和抗卒中型自發(fā)性高血壓大鼠（SHRSR）等SHR亞種。SHRSP出生后出現(xiàn)嚴(yán)重高血壓外，90%以上出現(xiàn)腦出血和腦栓塞；20周鼠齡SHRSP食用高Na+低K+飲食，很快就發(fā)生非常明顯的卒中，大約100%死于出血性卒中。SHRSR是抗腦出血和腦栓塞的自發(fā)性高血壓大鼠。(3)評價指標(biāo)遺傳性高血壓動物模型能模擬人類高血壓的自然過程，可用于高血壓發(fā)病機(jī)理、藥物干預(yù)的研究。應(yīng)激性高血壓模型突出了中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)激與高血壓的關(guān)系，但高血壓維持時間短，不適用于慢性研究。腎性高血壓模型需經(jīng)過一定的手術(shù)或其它附加因素處理，與人類高血壓病的發(fā)病機(jī)制不完全一致，但血壓升高較明顯，持久恒定，容易反應(yīng)出藥物的降壓作用；形成高血壓所需時間較短，工作量較小；同一動物模型可用來反復(fù)觀察各種藥物的降壓作用；與臨床降壓效果比較一致。

三、心肌缺血和心肌梗塞模型復(fù)制心肌梗塞模型多用哺乳動物，最常用的是犬。近年報導(dǎo)，豬冠狀循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)酷似人類，故提倡用家豬或小型豬作為心肌梗塞的實驗研究。兔、鼠等小動物，體積過小，取材受限，故使用的不多。靈長類動物雖然有不可比擬的優(yōu)越性，但其材料難得，不易普遍使用。國內(nèi)心肌缺血和心肌梗塞模型的復(fù)制方法有以下幾種：

1．電刺激法一般用成年雄性兔，麻醉后用定向儀將兩支涂絕緣漆的不銹鋼針，精確插入右側(cè)下丘腦背內(nèi)側(cè)核，以弱刺激（強(qiáng)度0.8~1.6mA）和強(qiáng)刺激（強(qiáng)度4~8mA）交替刺激該核團(tuán)，每次5min，間隔1~3min。數(shù)次后即可造成急性心肌缺血。

2．藥物法常用4%異丙基腎上腺素，大鼠皮下注射50mg/kg體重，或直接將藥物注入腹腔。也可經(jīng)犬靜脈給予麥角新堿0.2mg/kg體重。均可造成冠狀動脈痙攣。

3．冠脈阻斷法一般選用成年健康犬或兔，麻醉后開胸，多結(jié)扎其冠狀動脈前降支阻斷心肌供血，引起病變。也可采用閉胸式選擇性冠狀動脈插管法，在熒光屏下將心導(dǎo)管由犬的頸動脈切口處插入，沿主動脈壁直抵左竇底部，將其尖端送至左冠狀動脈內(nèi)約2cm深處，向?qū)Ч軆?nèi)注入汞（120mg/kg體重），造成急性心肌梗塞。

四、腦缺血模型

缺血性腦血管病是急性腦血管病中最常見的類型，因而用于腦缺血/再灌流(MCAO/R)研究的動物模型也較多。根據(jù)缺血的部位不同可分為全腦缺血和局灶性缺血/再灌流模型，根據(jù)缺血/再灌流的時間不同分為短暫性和永久性缺血模型，根據(jù)制備方法可分為開顱性和不開顱性兩大類。本節(jié)主要介紹線栓法制備局灶性腦缺血再灌流動物模型。

（一）線栓法制備局灶性腦缺血再灌流模型線栓法腦缺血再灌流模型的動物應(yīng)具備以下條件：易于飼養(yǎng)、繁殖，價格低廉，操作簡單，與人類腦梗死接近，病變部位容易控制，重復(fù)性好。1．實驗原理線栓法制備局灶性MCAO/R動物模型的機(jī)理是依靠插線的前端阻塞大腦前動脈，阻止經(jīng)大腦前動脈返流的血液，依靠插線的側(cè)壁阻塞頸內(nèi)動脈和后交通動脈，從而使一側(cè)大腦中動脈的血流完全中斷造成大腦中動脈閉塞腦缺血模型。將插線抽出后，恢復(fù)了上述返流的血液，可達(dá)到再灌注的目的，即短暫性局灶性腦缺血再灌流模型，如不抽線即為永久性局灶性腦缺血模型。2．實驗方法

將直徑0.2mm的尼龍線頭端烤成圓鈍狀或涂一層硅膠，使其直徑0.28mm，浸泡在肝素中備用。動物腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，暴露左側(cè)（或右側(cè)，根據(jù)需要而定）頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），注意勿過度刺激迷走神經(jīng)。分離并電凝ECA的甲狀腺上動脈和枕動脈分支，小心處理ICA的翼腭動脈分支（不結(jié)扎）。動脈夾夾閉CCA和ICA，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，在ECA靠遠(yuǎn)端處剪一小切口，將尼龍線頭端插入約18~22mm，至有阻力感即到MCA的起始部。然后結(jié)扎ECA近端，逐層縫合，使尼龍線暴露于體表約1cm。缺血后（時間根據(jù)實驗要求而定）拔出絲線至有阻力感，說明絲線頭部已離開ICA而位于ECA內(nèi)，將體外的絲線剪斷，完成缺血再灌注動物模型的制備。術(shù)中用100W燈泡照射保持肛溫36~37℃。手術(shù)時間超過30min、術(shù)中發(fā)生呼吸困難、出血量過多、術(shù)后2h仍不蘇醒的動物棄用。術(shù)后注意保溫，加強(qiáng)營養(yǎng)。3．評價指標(biāo)：動物蘇醒后，手術(shù)側(cè)出現(xiàn)Horner征，提尾手術(shù)對側(cè)前肢屈曲或爬行時向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者入選；TTC染色使正常腦組織染成紅色，缺血區(qū)無此反應(yīng)則顯白色。

4．優(yōu)缺點該模型的優(yōu)點是不需要特殊設(shè)備、不開顱，栓塞部位容易控制、成功率較高、重復(fù)性較好，栓塞機(jī)理與臨床腦血栓的機(jī)理較為接近。缺點是動物要求嚴(yán)格，體重、鼠齡盡可能一致，健康狀況要好，手術(shù)過程中要細(xì)致輕柔，以免刺破血管，而且手術(shù)時間長，死亡率高。由于顱內(nèi)血管存在變異，約有20%動物不出現(xiàn)梗塞灶和癥狀體征，實驗時應(yīng)棄用。

（二）全腦缺血/再灌注模型1979年，Pulsinelli首先建立了四血管閉塞全腦缺血/再灌注模型。大鼠麻醉后俯臥位固定，頸后部正中切口，暴露第一頸椎兩側(cè)的翼小孔，用直徑0.5mm的電灼針，插入雙側(cè)翼小孔中燒灼雙側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞。然后，將動物仰臥位固定，頸部正中切口，暴露雙側(cè)CCA用動脈夾，并夾閉造成腦缺血。根據(jù)需要，夾閉一定的時間后松開動脈夾，實現(xiàn)腦缺血再灌注。在電灼雙側(cè)椎動脈時，應(yīng)將組織分離完全，充分暴露雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動脈，否則，電灼椎動脈容易失敗。

五、腦出血模型根據(jù)制備方法的差異，腦出血模型大體可分為腦內(nèi)占位模型、人工誘發(fā)腦出血模型、高血壓卒中模型三類。多數(shù)實驗動物如鼠、兔、貓、狗、豬、猴和狒狒等，都可用來制做腦出血模型，但不同部位和不同類型的腦出血模型對選擇動物的要求也各不相同。用于治療學(xué)研究時最好選擇大腦半球較發(fā)達(dá)的動物，如貓、兔、狗和靈長類動物。由于大鼠具有：①腦血管解剖及生理較接近人類；②腦體積較少，易于病理學(xué)及生化學(xué)觀察；③價格低廉且容易管理和實施手術(shù)；④生理、生化、藥理、形態(tài)學(xué)方面實驗資料豐富，易于比較。以大鼠作為實驗性腦出血對象的研究日益廣泛，方法也較為成熟

（一）腦內(nèi)直接注血腦出血模型直接將自體新鮮血液或凝血塊注入動物腦內(nèi)（皮質(zhì)下、腦室、尾殼核、丘腦或基底節(jié)）產(chǎn)生實驗性腦出血是多數(shù)研究者用來建立腦出血模型的主要方法，其優(yōu)點是可成批制作，易于標(biāo)準(zhǔn)化，制作簡單。血腫制備方法有三種：①開顱后直視下注血；②按顱體表解剖標(biāo)志鉆孔注血；③立體定向、定位注血。大鼠等小動物多用立體定向方法注血，大動物如狗和猴等三種方法都可采用。

（二）膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型實驗研究表明，用含0.1~1.0U膠原酶的生理鹽水2μl，通過立體定向術(shù)經(jīng)微量注射器于9min內(nèi)注入尾殼核，0.5U膠原酶可誘導(dǎo)腦出血。該模型可適用于腦出血長期實驗研究。膠原酶是一種金屬蛋白酶，可以分解細(xì)胞基質(zhì)及血管基底膜的膠原蛋白，腦內(nèi)注射后20min即可損害腦血管基底膜上的膠原蛋白。血管壁受損后引起滲血，進(jìn)而血液逐漸積聚，約4h出血區(qū)融合成血腫。血腫的體積與注入的膠原酶呈劑量依賴性。組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，開始為散在的小片出血，繼而融合成大片血腫區(qū)。融合常不完全，出血區(qū)與腦組織混雜存在。

（三）蛛網(wǎng)膜下腔出血模型

1.顱內(nèi)動脈刺破法：應(yīng)用改良線栓法，將血管內(nèi)插線改用頭端尖銳的3-0單股絲線，由一側(cè)ECA進(jìn)入，導(dǎo)入同側(cè)ICA至頸動脈分叉處時，用線段的尖端刺破該動脈的分叉部，抽出導(dǎo)線，即可產(chǎn)生SAH模型。盡管該法破壞性較少，操作簡單，但刺破動脈的出血量和出血速度仍難以控制，仍只適用于急性CVS的研究。

2.開顱暴露實驗動脈：于該動脈處置一絲線并引出線的末端埋藏于皮下，若干天后將線抽出，造成相應(yīng)的動脈破裂及蛛網(wǎng)膜下腔出血。由于操作復(fù)雜，損傷嚴(yán)重，死亡率高，故該模型多用于急性實驗研究。

3.腦池注血法：腦池注血有5種：①枕大池注血法：枕大池穿刺注血法和開顱置管注血法；②視交叉池注血法：可直接經(jīng)內(nèi)眥或外眥進(jìn)針沿眶壁推進(jìn)，經(jīng)視神經(jīng)孔刺入視交叉池注血，或先去除眶內(nèi)容物后再穿刺視交叉池注血；③側(cè)腦室穿刺注血法；④經(jīng)顳頂部蛛網(wǎng)膜下腔穿刺注血法；⑤經(jīng)軟腭基底池穿刺注血法。

六、糖尿病模型目前，建立糖尿病模型的方法很多，其最基本的機(jī)制是通過物理、化學(xué)或生物損害因素，破壞胰島細(xì)胞的功能，導(dǎo)致胰島素缺乏，糖代謝發(fā)生障礙。（一）Ⅰ型糖尿病模型1．四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病模型四氧嘧啶是胰島β細(xì)胞毒性物質(zhì)，通過產(chǎn)生超氧陰離子自由基破壞β細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，β細(xì)胞合成前胰島素減少，最終導(dǎo)致胰島素缺乏，與胰島素依賴性糖尿?。á裥停╊愃啤４笫髮λ难踵奏ぽ^敏感，犬不敏感，豚鼠則抵抗。四氧嘧啶造模劑量，犬50~70mg/kg，靜注；大鼠40mg/kg，靜注，給藥速度宜快。相同劑量下，腹腔注射成功率較低，而皮下注射需要增加4~5倍量。禁食是影響造型結(jié)果的另一因素，如大鼠禁食48h，20mg/kg靜注可使大多模型成功。四氧嘧啶水溶液不穩(wěn)定，pH3.0時室溫穩(wěn)定；pH7.0時要保存在4℃以下。大鼠、小鼠造成模型后，部分動物經(jīng)30d可自發(fā)性緩解；造模給藥幾小時內(nèi)，有些動物（尤其是兔）有低血糖反應(yīng)，甚至死亡，可靜注葡萄糖急救。造模時四氧嘧啶應(yīng)新鮮配制，造模前各組動物的平均血糖相差不宜大于20mg/dl。

2．鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型

造摸機(jī)制與四氧嘧啶類似。雄性Wistar大鼠，體重120克左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食8h，以60mg/kg劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ），用0.1mmol/L（pH4.4）檸檬酸緩沖液配制。注射STZ后72h剪尾取血，用血糖儀測空腹血糖（FBG）≥16.7mmol/L且穩(wěn)定1周者，確定為1型糖尿病模型建立成功?？赏瑫r檢測血清胰島素（Fins）水平、血清C-肽（C-P）水平、血清糖化血紅蛋白水平、果糖胺水平、胰島素敏感指數(shù)（ISI）：ISI=ln〔1/(FIns×FBG)〕。分離取出胰腺組織，觀察組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化。

（二）Ⅱ型糖尿病模型雄性Wistar大鼠，體重120克左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食8h，以高糖高脂飼料（由10%豬油、20%蔗糖、10%蛋黃粉、1%膽酸鈉和59%常規(guī)飼料組成）喂養(yǎng)4周，再以30mg/kg體重的劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素。注射1周后剪尾取血，用血糖儀測空腹血糖≥7.0mmol/L者，確定為2型糖尿病模型建立成功。

七、肝炎模型目前常用的肝炎模型有：四氯化碳或氨基半乳糖急性肝損傷模型、四氯化碳和異種血清誘發(fā)肝纖維化模型、鴨乙肝病毒模型、乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠等。將乙肝病毒基因轉(zhuǎn)移到小鼠基因組中，造成人為感染并能代代相傳形成品系，解決了乙肝研究缺乏動物模型的難題，是乙肝新藥開發(fā)、藥物篩選及治療研究的理想動物模型。鴨乙肝病毒（DHBV）與人乙肝病毒（HBV）同屬嗜肝病毒，兩者的病毒大分子結(jié)構(gòu)和復(fù)制過程有很多相似之處，鴨乙肝病毒感染的鴨作為乙型肝炎動物模型已被普遍采用。

1．實驗方法取1日齡雄性綠頭鴨（南海大瀝江夏村孵化場），脛靜脈注射陽性病毒血清（DHBV陽性傳代血清），0.2ml/只，第2d，第10d分別于脛靜脈采血（0.5ml/只），分離血清用斑點雜交方法檢測，第15d出結(jié)果，保留先天感染DHBV陽性鴨。

2．評價指標(biāo)

DHBV-DNA含量定量分析：取上述鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA含量，按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點雜交（DotBlot）試驗。放射自顯影后進(jìn)行結(jié)果判斷，X線膠片上有斑點陰影者為陽性，用酶聯(lián)免疫析測儀對放射自顯影X線膠片上的斑點進(jìn)行光譜吸光度（A）檢測，對DHBV-DNA含量定量分析

八、腫瘤動物模型建立腫瘤動物模型可以探索腫瘤生長的本質(zhì)及其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為研究人類腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)和抗腫瘤新藥的發(fā)現(xiàn)提供重要依據(jù)。目前，腫瘤動物模型有自發(fā)性、誘發(fā)性和移植性腫瘤動物模型和腫瘤轉(zhuǎn)移模型幾種類型。

（一）自發(fā)性腫瘤動物模型實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理，在自然情況下發(fā)生腫瘤，稱為自發(fā)性腫瘤動物模型。動物自發(fā)性腫瘤發(fā)生于近交系動物，隨動物種屬、品系不同，腫瘤的發(fā)生類型和發(fā)生率有很大差異。其中，小鼠的各種自發(fā)性腫瘤在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究中具有重要意義。目前可用于腫瘤研究的小鼠品系或亞系有200多個。

自發(fā)性腫瘤動物模型與人類所患的腫瘤相似，有利于將動物結(jié)果引用到人類。而且自發(fā)性腫瘤的發(fā)生條件比較自然，可通過細(xì)致觀察和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)原來沒有發(fā)現(xiàn)的環(huán)境或其他的因素，可以觀察遺傳因素對腫瘤發(fā)生的作用。其缺點是，腫瘤的發(fā)生情況可能參差不齊，不可能在短時間內(nèi)獲得大量腫瘤學(xué)資料，觀察時間較長，實驗耗費較大。

（二）誘發(fā)性腫瘤動物模型

利用化學(xué)致癌物質(zhì)誘發(fā)實驗性腫瘤的動物模型，是進(jìn)行腫瘤實驗研究的常用模型。目前使用較多的化學(xué)致癌物質(zhì)有多環(huán)碳?xì)浠衔铩喯醢泛团嫉玖系?。?qiáng)烈致癌物質(zhì)誘發(fā)出來的腫瘤，惡性程度高，容易將其做成瘤細(xì)胞株（指一個可移植的動物腫瘤）。常用誘發(fā)腫瘤動物模型的方法有：經(jīng)口給藥法（胃癌）、涂抹法（鱗癌）、氣管灌注法（肺癌）、穿線法（宮頸癌）、注射法、埋藏法等。以下介紹3種誘發(fā)腫瘤動物模型。

1．甲基芐基亞硝胺（MBNA）誘發(fā)大鼠食管癌取體重100g以上的Wistar大鼠，任其飲用含MBNA的水，并將MBNA摻入飼料中，每日攝入量0.75~1.5mg/kg體重，80~100d即可誘發(fā)成食管癌。

2．二甲基芐阱（DMH）誘發(fā)大腸癌先配制0.4%的DMH溶液，每100ml加入EDTA27mg，用0.1mol/LNaOH調(diào)pH=6.5。以此液皮下注射4周齡雄性Wistar大鼠，每次21mg/kg體重，每周1次，連續(xù)21周，最后一次給藥后1~4周處死動物，取材觀察。3．乙基亞硝基脲（ENU）誘發(fā)大鼠膠質(zhì)瘤孕鼠經(jīng)胎盤給藥致其子代鼠成瘤，選擇健康Wistar孕鼠，體重350g左右，在妊娠晚期距預(yù)產(chǎn)期7d，經(jīng)尾靜脈一次性注射1%ENU溶液，60mg/kg體重。新生鼠皮下注射給藥致瘤，選擇3日齡健康Wistar大鼠，體重4g左右，于肩胛部或腰骶部一次性皮下注射用0.5%ENU溶液，60mg/kg體重。觀察12個月，即可誘發(fā)出腦和脊髓膠質(zhì)瘤。皮下注射法誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤，在組織學(xué)上以混合性少突-星型細(xì)胞瘤為主，偶伴發(fā)腎纖維肉瘤和肺癌。

（三）移植性腫瘤動物模型抗腫瘤藥物篩選最常用的是移植性腫瘤模型，這種模型雖有局限性，不能反應(yīng)出人體腫瘤的許多特點，但操作簡單，便于大量篩選抗腫瘤藥物。目前，世界上現(xiàn)存的動物移植性腫瘤有400余種，分同系或同種移植與異種移植兩大類。自體式同系動物腫瘤移植不產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，移植瘤株的穩(wěn)定性至關(guān)重要，為達(dá)到可靠的穩(wěn)定性，通常需連續(xù)傳代15代以上，其浸潤和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，以及對化療藥物的敏感程度均不確定。

1．動物的選擇根據(jù)瘤源需要，用純系或雜種動物。實驗用小鼠體重以18~24g，大鼠以50~80g為宜。所用動物必須發(fā)育良好，身體健康。

2．接種常規(guī)