第三章微生物細(xì)胞破碎微生物的外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜：細(xì)胞壁：為細(xì)胞外壁，具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷或滲透壓破壞的功能。細(xì)胞膜：為細(xì)胞內(nèi)壁，是一層具有高度選擇性的半透膜，控制細(xì)胞內(nèi)外一些物質(zhì)的交換滲透作用。

細(xì)胞破碎的主要阻力來自細(xì)胞壁，不同類型的微生物、處于不同生長時期的同一種微生物，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特性是不同的。一、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成1.細(xì)菌15~50nm40~90%肽聚糖1.5~2nm8~10nm2.酵母菌 由特殊的酵母纖維素構(gòu)成，其主要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、蛋白質(zhì)（6-8%）和脂類，比G+更難破碎。酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意圖M——甘露聚糖；P——磷酸二酯堿；G——葡聚糖酵母細(xì)胞3.霉菌

霉菌細(xì)胞壁主要由多糖（80-90%）組成，含較少的蛋白質(zhì)和脂類，結(jié)構(gòu)和纖維素很相似。

由于霉菌細(xì)胞壁中含幾丁質(zhì)或纖維素的結(jié)構(gòu)，其強度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。二、細(xì)胞破碎方法1、珠磨法（Beadmill）玻璃(2.5g/mL)氧化鋯(6.0g/mL)粒徑(0.1~1.0mm)填充率(80~85%)ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)珠磨法是利用玻璃珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌，由于研磨作用，使細(xì)胞獲得破碎。

攪拌設(shè)計要能夠給予研磨劑以最佳推動力，一般設(shè)計為攪拌盤。攪拌盤與驅(qū)動軸有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有傾斜的。有的攪拌盤上有凹槽或是開度口以幫助攪拌。珠磨機(jī)攪拌盤設(shè)計圖珠磨機(jī)攪拌盤與驅(qū)動軸方位示意圖S破碎率；t為破碎操作時間或平均停留時間;k破碎速度常數(shù)，與攪拌轉(zhuǎn)速、料液的循環(huán)流速、細(xì)胞懸浮液的濃度、玻璃小珠直徑以及溫度等操作因素相關(guān)

微珠直徑：目標(biāo)細(xì)胞直徑=30～100細(xì)菌濃度60~120g/L酵母濃度140~180g/L優(yōu)點：容易操作，破碎率可控制，易放大；實驗室和工業(yè)規(guī)模均可用；絕大多數(shù)微生物細(xì)胞均適用。缺點：產(chǎn)生大量熱能，能量利用率僅1%；影響破碎率的操作參數(shù)較多，操作過程優(yōu)化較復(fù)雜。2、高壓勻漿法(High-pressurehomogenization)高壓勻漿法是利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂。高壓勻漿器針型閥結(jié)構(gòu)簡圖高壓勻漿器各種閥型設(shè)計壓力：50~70MPa速度：450m/s原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力作用下破碎。

在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞懸液，常采用多次循環(huán)的操作方法。其破碎屬于一級反應(yīng)速度過程，被破碎的細(xì)胞分率符合下式，破碎的動力學(xué)方程可表示為：式中R——細(xì)胞破碎率

K——與溫度等有關(guān)的破碎常數(shù)

N——懸浮液通過勻漿器的次數(shù)

P——操作壓力

a——與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。高壓勻漿法—適合于酵母和細(xì)菌的大規(guī)模破碎；不適于絲狀菌破碎。NOTICE:3、X－press法將濃縮的菌體懸浮液冷卻至－25℃至－30℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。

細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。此法稱為X－press法，主要用于實驗室中。

該法的優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。

該法對冷凍－融解敏感的生化物質(zhì)不適用。4、超聲波破碎

是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細(xì)胞破碎。

破碎原理： 在高的輸入聲能下，液體各個成核部位會形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會增大，而在壓縮相中氣泡會被壓縮，直到不能再壓縮時，氣泡破裂，釋放出猛烈的展波。這種震波通過介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量聲能被轉(zhuǎn)化成彈性波形式的機(jī)械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。頻率超過15-20KHz優(yōu)點：適合于多種細(xì)胞的破碎；處理少量樣品操作方便；液體損失少；破碎率高。缺點：有效能量利用率低，產(chǎn)熱大，需控溫（冰水或通冷卻劑）；不易放大，僅應(yīng)用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎；影響因素多：細(xì)胞種類、濃度、超聲波的聲頻等。（1）酶解法 利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁的特殊化學(xué)鍵，從而達(dá)到破壁的目的。2、非機(jī)械法常用的溶酶溶菌酶；β-1，3-葡聚糖酶；β-1，6-葡聚糖酶；蛋白酶；甘露糖酶；糖苷酶；肽鍵內(nèi)切酶；殼多糖酶等。溶菌酶能專一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。

對酵母細(xì)胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。

利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。Example優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物;條件溫和;核酸泄出量少;細(xì)胞外形完整。缺點：溶酶價格高;溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶）;產(chǎn)物抑制的存在。自溶作用是酶解的另一種方法，所需溶酶是由微生物自身產(chǎn)生的。

影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。

自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。

（2）滲透壓沖擊

是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。

（3）反復(fù)凍結(jié)—融化

凍結(jié)－融化法系將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加了細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。

僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體。但通常破碎率很低，即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。（4）干燥法

可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。它使細(xì)胞膜滲透性改變，當(dāng)用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。空氣干燥主要適用于酵母菌，一般在25－30℃的氣流中吹干，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提?？諝飧稍飼r，部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干燥容易抽提。真空干燥適用于細(xì)菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后的菌體在冷冰條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。（5）化學(xué)滲透法

某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。

該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細(xì)胞破碎。表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。EDTA螯合劑酸堿破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，適用于酸堿穩(wěn)定的產(chǎn)品能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。有機(jī)溶劑變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲素（Urea）是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)

如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)

仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)

一步提取。值得一提的是，除了應(yīng)研究破碎細(xì)胞的方法外，還應(yīng)研究在生物合成過程中減低細(xì)胞牢固程度的方法。三、目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的位置：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)細(xì)胞膜或細(xì)胞壁附近（如革蘭氏陰性菌周質(zhì)空間中的蛋白）細(xì)胞膜或細(xì)胞壁處于結(jié)合狀態(tài)選擇性釋放：使細(xì)胞不完全破碎，選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物，盡量減少其他物質(zhì)的釋放。選擇性釋放原則：僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置

細(xì)胞膜附近：溫和的方法(酶法)，或采用較溫和的機(jī)械破碎條件，降低細(xì)胞破碎程度。細(xì)胞內(nèi)：機(jī)械破碎選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物

目標(biāo)產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁處于結(jié)合狀態(tài)調(diào)整溶液pH、離子強度、添加能夠溶解釋放目標(biāo)產(chǎn)物的試劑(如表面活性劑、螯合劑)?；瘜W(xué)滲透法選擇性釋放胞內(nèi)產(chǎn)物流程圖四、破碎率的測定a.直接測定

利用顯微鏡觀察或計數(shù)；染色可將破碎細(xì)胞和完整細(xì)胞區(qū)分開。如革蘭氏染色能將破碎后的革蘭氏陽性菌染成陰性菌的顏色；受損的酵母細(xì)胞為亮紅色，未受損的酵母細(xì)胞為紫色。b.測定釋放的蛋白量或酶活

將破碎后的細(xì)胞懸液離心，測定上清液中蛋白濃度或酶活。c.測電導(dǎo)率電導(dǎo)率隨破碎率的增加而線性增加五、細(xì)胞破碎的發(fā)展趨勢1、多種破碎方法相結(jié)合

化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞膜壁的化學(xué)組成，機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強度，而化學(xué)組成又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強度，組成的變化必然影響到強度的差異，這就是化學(xué)法或酶法與機(jī)械法相結(jié)合的原理。2、與上游過程相結(jié)合

（1）克隆噬菌體裂解基因

λ噬菌體裂解基因

舉例：

于慧敏等構(gòu)建得到了一株具有λ噬菌體裂解基因的產(chǎn)PHB重組大腸桿菌，通過發(fā)酵后期升高溫度至50℃保溫2h，或者加入螯合劑EDTA，均可使細(xì)胞裂解釋放出目標(biāo)產(chǎn)物PHB。圖不同時刻和裂解處理前后的PHB顆粒PHB：聚-β-羥基丁酸酯，是一種生物可降解塑料

（2）耐高溫產(chǎn)品的