第三章培養(yǎng)用液

培養(yǎng)用液是維護(hù)組織細(xì)胞生存、生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液。主要包括平衡鹽溶液

培養(yǎng)基

其他培養(yǎng)用液

天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基

第一節(jié)水和平衡鹽溶液細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。

需要用新鮮(一周內(nèi)）的三蒸水或純化水

純化水的貯存對保持水的質(zhì)量有很大影響：需用玻璃容器；周圍環(huán)境和空氣能使水污染，或改變其pH，所以要盡量減少啟開的次數(shù),避免和外界多接觸,存放時(shí)間不宜太長,最好現(xiàn)制現(xiàn)用。一、細(xì)胞培養(yǎng)對水的要求2、平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）

組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。

用途：取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。

注意：配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用純化水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。滅菌方法：過濾除菌或高溫高壓滅菌。

幾種常用的平衡鹽溶液：

PBS、Hank’s、D-Hank’s（都有相應(yīng)配方,主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成）D-Hank’s與Hank’s的一個(gè)主要區(qū)別在于前者不含有Ca2+、Mg2+

因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。

D-Hanks’平衡鹽溶液

(D-HanksBalancedSaltSolutions)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

第二節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)物質(zhì),它是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求:體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

一、培養(yǎng)基中主要的成分1.氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸（均為Ｌ型）。

2.碳水化合物：葡萄糖

3.維生素：葉酸、煙酰胺、吡哆醛、核黃素、硫胺素等。4.無機(jī)離子與微量元素：鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素以及鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等微量元素。

1、天然培養(yǎng)基：即組織提取物和體液。

如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。

2、合成培養(yǎng)基:需要添加血清培養(yǎng)細(xì)胞。3、無血清培養(yǎng)基

不需要添加血清就可維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的分類：市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜、保存方便。缺點(diǎn)是配制過程比較繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)模化生產(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便，但比較昂貴。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F10等三、如何選擇培養(yǎng)基？(1)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基。(2)本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基(3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基

四、培養(yǎng)基的配制：

（1）認(rèn)真閱讀說明書。（2）配制時(shí)要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。（3）配制所用的水應(yīng)為純化水（三蒸水），離子濃度很低，水電阻達(dá)30萬Ω以上。（4）所用器皿應(yīng)十分潔凈。（5）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4℃。

DMEM培養(yǎng)液的配制（舉例）900mL純化水于1000mL燒杯中，將DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50mL純化水分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。用5％－10％的NaHCO3調(diào)pH至7.2加青、鏈霉素至終濃度100u/mL和100ug/mL用容量瓶定容到1000mL用0.22um的濾膜過濾除菌。分裝（200mL左右）后4℃冰箱保存。

五、血清：細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)基被稱為“完全培養(yǎng)基”。血清終濃度多為5％～20%。最常用的是10%。

廣泛應(yīng)用的血清種類有馬血清與牛血清，后者又分為胎牛血清、新生牛血清與小牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新生牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10～30天的小牛。

1、血清的主要作用(1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)(2)提供貼壁和擴(kuò)展因子(3)提供激素及各種生長因子(4)提供結(jié)合蛋白(5)對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用

2、細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)(1)有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)(2)血清中含有一些物質(zhì)對細(xì)胞會產(chǎn)生毒性作用(3)每批血清之間都有差別,其成分不能保持一致。(4)取材過程有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響(5)直接影響某些實(shí)驗(yàn)，如生長因子的檢測3、血清質(zhì)量的判斷：對于使用者來說，血清質(zhì)量首先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少量沉淀，比較粘稠。4、血清的使用與儲存

（1）瓶裝血清解凍步驟:-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由－20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

(2)使用前的處理：血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。

熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。

對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

（3）儲存條件：血清一般儲存于－20℃,同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融

大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如10ml、20ml、50ml，儲存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜長時(shí)間存放，勿超過一個(gè)月，應(yīng)盡快使用。（4）血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清舉例清亮小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)六、其他培養(yǎng)用液

１、消化液

取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁的細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有：

（1）胰蛋白酶(trypsin)溶液：濃度一般為0.1％～0.25％配制時(shí)要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（2）EDTA溶液：使用濃度為0.02%；對于一些貼壁特別牢的細(xì)胞，可與胰酶的混合使用

一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存（3）膠原酶(collagenase)溶液：使用濃度為0.1～0.3mg／L或20萬U／L，作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用PBS。

膠原酶作用溫和，不易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用。

缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴

２、谷氨酰胺補(bǔ)充液合成培養(yǎng)基中必需成分，但容易降解，所以都是在使用前添加。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，配制時(shí)應(yīng)加溫至30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于-20℃。3、pH調(diào)整液常用的有HEPES液

NaHCO3NaHCO3溶液（常用）常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES常配成1M儲存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L

４、抗生素液青、鏈霉素的配制及使用濃度青霉素80萬U加Hank’s液至80mL，濃度1萬u/mL鏈霉素100萬U（相當(dāng)于1g）加Hank’s液至100m