條件性基因敲除與敲入第1頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在科學(xué)研究中，為了明確某一組織或器官的功能，常將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)所要研究的組織或器官切除，進(jìn)而根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理指標(biāo)或功能的變化來(lái)推測(cè)切除部分的功能。生命科學(xué)發(fā)展到今天，人們對(duì)于生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)已經(jīng)逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除—觀察整體—推測(cè)功能”的研究思想仍然有效。具體地說(shuō)，就是在分子水平破壞想要研究的基因，然后觀察生物體的生理指標(biāo)、功能、整體形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、發(fā)育過(guò)程的變化等，進(jìn)而推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這種研究過(guò)程稱為基因敲除(geneknockout)。此外，為了研究某種疾病與某個(gè)基因之間的關(guān)系，常向生物體內(nèi)人為引入某個(gè)基因，然后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)的各種變化，從而推測(cè)疾病與基因的關(guān)系，這種研究方法稱為基因敲人(geneknockin)。第2頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)現(xiàn)基因敲除的方法有多種，但基本上都是采用同源重組或隨機(jī)整合的方法，讓一段沒(méi)有生理功能的DNA片段在細(xì)胞內(nèi)取代正?；?，從而破壞正?；虻墓δ??；蚯贸饕窃谂咛ジ杉?xì)胞(embryonicstemcells，ESC)水平進(jìn)行操作。胚胎干細(xì)胞是早期胚胎細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)建立的全能細(xì)胞系，在體外培養(yǎng)時(shí)保持了未分化狀態(tài)，可以傳代增殖，在發(fā)育上類似于早期胚胎細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，具有與早期胚胎細(xì)胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點(diǎn)，是研究哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機(jī)制的理想模型。首先在這種細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分子水平的基因操作，之后再使這種已經(jīng)發(fā)生了基因改變的細(xì)胞發(fā)育成為一個(gè)完整的生物體。這樣就可以在整個(gè)生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)預(yù)期的基因改變。

第3頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)典的基因敲除的具體實(shí)施方法可以簡(jiǎn)述如下：選擇需要研究的目的基因的部分或全部DNA片段，通過(guò)分子生物學(xué)方法使其產(chǎn)生突變，然后與相應(yīng)的載體進(jìn)行重組，成為靶載體。分離試驗(yàn)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，在體外將上述靶載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其與細(xì)胞內(nèi)相似或相同的序列進(jìn)行同源重組，替代細(xì)胞內(nèi)原來(lái)的基因。通過(guò)一定的篩選方法篩選出發(fā)生同源重組的細(xì)胞，再將其注入囊胚腔內(nèi)；把經(jīng)過(guò)上述處理的囊胚重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其發(fā)育成為一個(gè)完整的個(gè)體。含有相應(yīng)突變基因的嵌合體雄性小鼠與正常雌性小鼠進(jìn)行交配后，通過(guò)篩選可獲得攜帶該突變基因的純合子小鼠。第4頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月通過(guò)上述方法所獲得的基因敲除小鼠模型，其身體的各種組織、器官以及小鼠生存的各個(gè)時(shí)期都攜帶有突變基因，相應(yīng)基因的功能也發(fā)生了變化。這是一種非常經(jīng)典的基因敲除方法，該方法對(duì)闡明某些基因的功能做出了十分重要的貢獻(xiàn)。但是，對(duì)于某些特殊的基因，該方法往往顯得無(wú)能為力，這些基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中或者在成熟生物體內(nèi)具有至關(guān)重要的功能。當(dāng)這些基因突變后，胚胎往往不能發(fā)育至正常分娩，或者即使能夠出生也會(huì)因?yàn)檫^(guò)于嚴(yán)重的生理缺陷而過(guò)早夭亡，無(wú)法開展后續(xù)研究，或者這些基因突變后影響到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁殖功能而不能產(chǎn)生后代，進(jìn)而不能獲得攜帶突變基因的純合子動(dòng)物模型。針對(duì)上述問(wèn)題，近年來(lái)出現(xiàn)了一種特殊的基因敲除或敲入方法，被稱為條件性基因敲除或敲入(conditionalgeneknockoutorknockin)。這種方法是指在特定的組織細(xì)胞或者細(xì)胞發(fā)育的特定階段敲除某一特定基因的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于克服了經(jīng)典基因敲除手段所遇到的上述問(wèn)題，對(duì)于在特定的組織細(xì)胞和(或)特定的時(shí)間研究特定基因的功能，以及更好地建立人類疾病的動(dòng)物模型都具有十分重要的意義。第5頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、條件性基因敲除的策略

——Cre/loxP重組系統(tǒng)第6頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．Cre/loxP系統(tǒng)的原理Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)loxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。第7頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月loxP（locusofX-overP1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是由兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了loxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：第8頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，可以分成三種情況：

1、如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的序列；

2、如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的序列倒位；

3、如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。第9頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．Cre/loxP系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)Cre/loxP系統(tǒng)之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應(yīng)用，是由該系統(tǒng)的諸多優(yōu)點(diǎn)決定的：①Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA片斷形成復(fù)合物后，可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過(guò)程，因此該系統(tǒng)不需要細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子；②loxP位點(diǎn)是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理?xiàng)l件下發(fā)揮作用；④Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動(dòng)子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理?xiàng)l件下產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮作用，這一點(diǎn)也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過(guò)程中最為重要的一點(diǎn)。第11頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3．Cre/loxP系統(tǒng)的工作流程利用Cre/loxP系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，首先在體外構(gòu)建一個(gè)在目的基因兩端分別含有一個(gè)loxP位點(diǎn)的基因序列，之后將體外構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)，使其通過(guò)同源重組替代細(xì)胞基因組內(nèi)原來(lái)的基因序列。經(jīng)過(guò)這樣處理的胚胎干細(xì)胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎，最終成為一只轉(zhuǎn)基因小鼠。在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中，loxP位點(diǎn)被引入到相應(yīng)基因的內(nèi)含子內(nèi)，理論上不會(huì)對(duì)相應(yīng)基因的功能產(chǎn)生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第12頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二只轉(zhuǎn)基因小鼠一般采用卵母細(xì)胞注射或者胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動(dòng)子的調(diào)控之下，可以使其在某特定的條件下表達(dá)。最后，讓這兩只小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生的同時(shí)含有上述兩種基因型的子代小鼠就會(huì)在某一特定類型的細(xì)胞中缺失某一特定的基因。很明顯，在何種組織細(xì)胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動(dòng)子。只要選擇合適的啟動(dòng)子調(diào)控Cre重組酶的表達(dá)，使其在生物體特定的部位、特定的條件下產(chǎn)生，就可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的敲除。第13頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第14頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月迄今為止，研究者們已經(jīng)成功地利用多個(gè)不同的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了在不同條件下的基因敲除，這些啟動(dòng)子可以是細(xì)胞類型特異的，如lck啟動(dòng)子(胸腺細(xì)胞)、alphaA晶狀體球蛋白啟動(dòng)子(眼晶狀體)、鈣調(diào)素依賴性激酶Ⅱ啟動(dòng)子(海馬和大腦新皮質(zhì))、乳清酸性蛋白啟動(dòng)子(乳腺)、aP2啟動(dòng)子(脂肪組織)、AQP2啟動(dòng)子(腎臟集合管)和肌漿蛋白啟動(dòng)子(骨骼肌)等。啟動(dòng)子也可以受某些外源性化學(xué)物質(zhì)的調(diào)控，外源性調(diào)控的基因敲除可以避免在胚胎發(fā)育早期由于基因功能的異常所產(chǎn)生的副作用，如干擾素反應(yīng)Mxl啟動(dòng)子、他莫西酚依賴的雌激素突變體啟動(dòng)子和四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)等。第15頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建

loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在基因組中待修飾基因區(qū)域的兩側(cè)各插入了1個(gè)loxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建首先需要一種特殊的載體，這種載體主要由3個(gè)部分組成：①分別存在于打靶載體5’和3’臂端，是與靶基因一定區(qū)域相同的同源序列，其作用是介導(dǎo)打靶載體與靶基因之間的同源重組。②位于5’和3’臂端之間有待敲除的靶基因區(qū)段序列或有待敲入的外源序列和選擇標(biāo)志基因。選擇標(biāo)志基因一般為neo—tk基因，含有兩個(gè)選擇標(biāo)志：一個(gè)為G418抗性基因(neo)，為細(xì)胞提供針對(duì)G418的抗性，為正篩選標(biāo)記；另一個(gè)為胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培養(yǎng)基中的更昔洛韋(ganciclovir)磷酸化為對(duì)細(xì)胞有毒的化合物，為細(xì)胞提供負(fù)篩選標(biāo)記。③3個(gè)loxP位點(diǎn)，分別位于待敲除靶基因同源序列的兩側(cè)和選擇標(biāo)志基因的兩側(cè)。一般采用線性化的打靶載體來(lái)轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，常選用位于同源序列邊緣或之外的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)作為打靶載體線性化的切點(diǎn)。取代型打靶載體整合進(jìn)基因組的結(jié)果是靶載體中的序列置換掉基因組中的同源序列。第16頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建一般采用胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移法。在這個(gè)過(guò)程中，首先要構(gòu)建具有3個(gè)loxP位點(diǎn)的打靶載體。該載體中l(wèi)oxP位點(diǎn)的分布情況如下：選擇標(biāo)志基因(如neo—tk)的兩側(cè)各一個(gè)，從而能夠使選擇標(biāo)志基因在Cre的介導(dǎo)下消失，以避免它們?cè)诨蚪M中的存在可能給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物造成危害；預(yù)期要進(jìn)行敲除的基因兩側(cè)各一個(gè)，在Cre的作用下可以介導(dǎo)目標(biāo)基因的敲除。在載體構(gòu)建成功后，用電穿孔等方法將其導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞中，使其以同源重組的方式整合進(jìn)干細(xì)胞的基因組，之后經(jīng)G418篩選，用PCR和DNA印跡(Southernblotting)等方法來(lái)確定靶基因是否發(fā)生了同源重組。最后，為了去除篩選標(biāo)志基因，要向上述的胚胎干細(xì)胞中導(dǎo)人Cre的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒。這時(shí)，在Cre的作用下，具有3個(gè)loxP位點(diǎn)的靶基因區(qū)域會(huì)產(chǎn)生3種后果：第17頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①發(fā)生Ⅰ型缺失，3個(gè)loxP之間的所有基因(靶基因和選擇標(biāo)志基因)全部被切除，只保留1個(gè)loxP位點(diǎn)。②發(fā)生Ⅱ型缺失，只有選擇標(biāo)志基因被切除，兩個(gè)loxP位點(diǎn)及其之間的靶基因被保留。發(fā)生了Ⅰ或Ⅱ型缺失的胚胎干細(xì)胞在更昔洛韋選擇培養(yǎng)下均能生長(zhǎng)，再用PCR和DNA印跡等方法來(lái)對(duì)缺失突變的結(jié)果進(jìn)行鑒定。③Ⅲ型缺失，靶基因被切除而選擇標(biāo)志基因被保留，發(fā)生此型突變的細(xì)胞在更昔洛韋存在時(shí)無(wú)法生存。經(jīng)過(guò)更昔洛韋培養(yǎng)基篩選后，可以篩選出發(fā)生Ⅱ型缺失的胚胎干細(xì)胞。再用囊胚注射法將經(jīng)過(guò)這種遺傳改造的胚胎干細(xì)胞注入囊胚，最后移植入代孕母鼠的子宮內(nèi)，獲得具有Ⅱ型缺失突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在其基因組中特定的基因位置具有兩個(gè)loxP位點(diǎn)。第18頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第19頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月受精卵雄性原核顯微注射法構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物即時(shí)空特異性表達(dá)重組酶Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。構(gòu)建此動(dòng)物的目的在于為loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供重組酶Cre。由于在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中Cre的表達(dá)被置于特異性啟動(dòng)子的調(diào)控之下，因此它會(huì)以組織細(xì)胞特異性和發(fā)育階段特異性的方式向loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供Cre重組酶，以便在特定的發(fā)育階段、特定的組織細(xì)胞中使兩個(gè)loxP之間的區(qū)域缺失。當(dāng)然，實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的最后方法就是讓這兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行雜交。構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與構(gòu)建普通轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法相似，最為常用的基因轉(zhuǎn)移方法仍為受精卵雄性原核顯微注射法和胚胎干細(xì)胞的囊胚注射法。第20頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月先將Cre時(shí)空特異表達(dá)載體線性化后注入雄性原核，使其以隨機(jī)插入的方式整合進(jìn)基因組，然后將該受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的輸卵管或子宮內(nèi)。受精卵雄性原核顯微注射法的具體步驟簡(jiǎn)述如下：1．準(zhǔn)備假孕母鼠

將可育雌鼠與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，刺激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠作為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母。2．受精卵的準(zhǔn)備

可育雌鼠注射孕馬血清與絨毛膜促性腺激素(HCG)，以促使其超排卵。處理后與可育雄鼠交配，次日從輸卵管內(nèi)收集受精卵備用。3．基因?qū)?/p>

用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)。4．胚胎移植將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟。5．對(duì)幼鼠的鑒定(1)幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合。(2)建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代后，后代有50％概率帶有整合的基因供實(shí)驗(yàn)用。也可將合適的組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，建立細(xì)胞系。(3)自小鼠內(nèi)臟提取RNA，與目的基因探針做分子雜交，以鑒定外源基因的表達(dá)和表達(dá)的組織特異性。表達(dá)產(chǎn)物可以測(cè)定活性的，也可直接自血液或組織測(cè)定活性蛋白質(zhì)，常用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或放射免疫測(cè)定(RIA)等。亦可取胚胎進(jìn)行分析。第21頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月受精卵雄性原核顯微注射法構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第22頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月胚胎干細(xì)胞的囊胚注射法構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

先將Cre時(shí)空特異表達(dá)載體線性化，之后用電穿孔等方法將其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中，并以同源重組的方式整合進(jìn)胚胎干細(xì)胞的基因組。這種經(jīng)過(guò)遺傳改造的胚胎干細(xì)胞再被注入囊胚，最后將胚胎植入假孕母鼠的子宮，使其發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體。囊胚注射法的具體步驟如下：(1)選擇合適的載體，將Cre重組酶的編碼基因與其重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒。(2)重組質(zhì)粒線性化后，用電穿孔、脂質(zhì)體等方法將其轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞中。(3)體外篩選穩(wěn)定整合外源基因的胚胎干細(xì)胞。(4)篩選出的胚胎干細(xì)胞被重新注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育為一個(gè)完整的胚胎。(5)產(chǎn)出的嵌合體小鼠通過(guò)雜交，最終獲得穩(wěn)定整合Cre重組酶的純合體轉(zhuǎn)基因小鼠。第23頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第24頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月采用雄性原核顯微注射法時(shí)，Cre表達(dá)基因是隨機(jī)的整合到基因組中去的，因此其表達(dá)的時(shí)空特異性和表達(dá)水平除了受啟動(dòng)子的影響外，還會(huì)受到整合位點(diǎn)的影響，因此需要同時(shí)生產(chǎn)多個(gè)轉(zhuǎn)基因鼠家系，以便從中選出符合要求的轉(zhuǎn)基因鼠。采用這種方法時(shí)選擇合適的啟動(dòng)子就顯得尤為重要。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作過(guò)程比較省時(shí)省力。另外一種構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的方法是采用同源重組，使Cre基因置于內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制之下。這個(gè)策略可以實(shí)現(xiàn)Cre基因表達(dá)的最佳化，因?yàn)檫@時(shí)所有的基因表達(dá)調(diào)控元件均處于天然位置，可以避免常規(guī)轉(zhuǎn)基因小鼠通常出現(xiàn)的異位表達(dá)問(wèn)題。此外，采用這種方法只要獲得靶基因的同源序列就可以進(jìn)行，沒(méi)有必要再去詳細(xì)研究其啟動(dòng)子。但是該方法的缺點(diǎn)是操作過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，當(dāng)有合適的啟動(dòng)子可供選擇時(shí)，多數(shù)研究者寧愿使用雄性原核顯微注射法生產(chǎn)Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。第25頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由此我們知道，Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵在于控制Cre基因表達(dá)啟動(dòng)子的選擇，因?yàn)閱?dòng)子活性的時(shí)空特異性決定了Cre基因表達(dá)的時(shí)空特異性，進(jìn)而決定Cre介導(dǎo)的loxP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組中相應(yīng)靶基因發(fā)生預(yù)期突變的時(shí)空特異性?？梢岳斫?，借助于Cre/loxP系統(tǒng)的作用，利用一種Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就可分別對(duì)多種基因在個(gè)體發(fā)育或疾病發(fā)生中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。理論上，Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除具有對(duì)任何發(fā)育階段的任何組織細(xì)胞中的任何基因進(jìn)行功能研究的潛力。第26頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月條件性基因敲除的實(shí)現(xiàn)

在構(gòu)建好上述兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠后，條件性基因敲除就比較容易實(shí)現(xiàn)了。所需要進(jìn)行的最后一步操作就是讓這兩種轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配。所產(chǎn)生的子代小鼠同時(shí)具有Cre的外源表達(dá)基因和經(jīng)過(guò)loxP修飾的目的基因，根據(jù)Cre表達(dá)的時(shí)空特異性就可以實(shí)現(xiàn)目的基因在特定組織中、特定發(fā)育階段發(fā)生預(yù)期的改變。第27頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第28頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基于Cre/loxP系統(tǒng)建立的四環(huán)素誘導(dǎo)條件性基因敲除系統(tǒng)該系統(tǒng)包含兩個(gè)互補(bǔ)系統(tǒng)，分別為tTA依賴和rtTA依賴的基因敲除系統(tǒng)，現(xiàn)在又被稱為Tet—Off(tTA依賴)系統(tǒng)和Tet—On(rtTA依賴)系統(tǒng)。在這兩個(gè)系統(tǒng)中，四環(huán)素控制轉(zhuǎn)錄因子tTA或rtTA與啟動(dòng)子Ptet的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。所不同的是tTA與啟動(dòng)子Ptet的結(jié)合是不需要四環(huán)素的，四環(huán)素阻礙兩者之間的相互作用；而rtTA與啟動(dòng)子Ptet的相互結(jié)合只有在四環(huán)素或者其衍生物多西環(huán)素(強(qiáng)力霉素)存在的情況下才會(huì)發(fā)生，沒(méi)有四環(huán)素或者多西環(huán)素時(shí)兩者不發(fā)生相互作用。因此這兩個(gè)系統(tǒng)以相反的方式對(duì)四環(huán)素進(jìn)行反應(yīng)，成為兩個(gè)互補(bǔ)系統(tǒng)。第29頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月該系統(tǒng)含有3個(gè)基本的要素：tTA或rtTA，Ptet，四環(huán)素或多西環(huán)素。其中tTA或rtTA作為一種轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)融合蛋白，具有兩部分：一部分為來(lái)源于原核生物體內(nèi)的四環(huán)素阻礙蛋白(Tetrepressor，TetR)；另一部分為來(lái)源于真核生物體內(nèi)，是真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用最為廣泛的是單純皰疹病毒編碼的VPl6的酸性結(jié)構(gòu)域。這兩部分構(gòu)成的融合蛋白(tTA或rtTA)可以受四環(huán)素或者其衍生物的調(diào)節(jié)而發(fā)生構(gòu)象變化，從而改變與相應(yīng)的DNA序列(四環(huán)素抗性元件，Tetresistanceoperon，TetO)的結(jié)合能力。tTA或rtTA的另一個(gè)功能就是轉(zhuǎn)錄激活功能，當(dāng)其在真核細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)的DNA反應(yīng)元件結(jié)合后可以啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。rtTA與tTA相比有幾個(gè)氨基酸位置的突變，突變的結(jié)果是兩者對(duì)四環(huán)素反應(yīng)后產(chǎn)生的效應(yīng)完全相反。rtTA只有在四環(huán)素存在的情況下才能與反應(yīng)元件TetO相結(jié)合，而tTA只有在四環(huán)素不存在的情況下才能與TetO結(jié)合。在具體的應(yīng)用中，tTA或rtTA被置于特定啟動(dòng)子的調(diào)控之下，以實(shí)現(xiàn)其在特定的組織器官中進(jìn)行表達(dá)。第30頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Ptet是一個(gè)受tTA或rtTA調(diào)控的啟動(dòng)子，含有一個(gè)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的最小功能單位和若干個(gè)TetO序列，該啟動(dòng)子只有與tTA或rtTA結(jié)合時(shí)才能激活下游基因的表達(dá)。因此，在應(yīng)用過(guò)程中Ptet被用來(lái)調(diào)控Cre重組酶的產(chǎn)生。四環(huán)素或多西環(huán)素作為Tet—On和Tet—Off系統(tǒng)的效應(yīng)劑，與tTA或rtTA相互作用從而調(diào)節(jié)它們與Ptet的親和力。多西環(huán)素是四環(huán)素的衍生物，由于其具有毒性小、所用劑量小等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中更為廣泛。該系統(tǒng)發(fā)揮作用的機(jī)制如圖所示。第31頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

采用該系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因敲除時(shí)，要將受特異性啟動(dòng)子調(diào)控的tTA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，同時(shí)還要將受Ptet啟動(dòng)子調(diào)控的Cre重組酶的表達(dá)載體也轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)。這樣一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠與loxP的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生的子代小鼠中會(huì)在特定組織和器官中表達(dá)tTA，tTA再與Ptet結(jié)合后激活下游的Cre重組酶的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)特定基因在特定組織器官中的敲除。如果在子代小鼠出生時(shí)就給予四環(huán)素，并且一直維持下去，特定基因的敲除就不會(huì)發(fā)生，只有在停止四環(huán)素的應(yīng)用后才會(huì)發(fā)生該基因在特定部位的丟失。采用rtTA系統(tǒng)與上述情況正好相反，在不用四環(huán)素時(shí)基因敲除不發(fā)生，只有給予四環(huán)素時(shí)才會(huì)導(dǎo)致特定基因在特定部位的敲除。因此，該系統(tǒng)可以對(duì)靶位點(diǎn)的剔除或修飾進(jìn)行時(shí)間和空間二維調(diào)控。第33頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基于Cre/loxP系統(tǒng)建立的他莫昔芬誘導(dǎo)條件性基因敲除系統(tǒng)該系統(tǒng)將雌激素受體(estrogenreceptor