中藥蛋白質組學研究1994年澳大利亞Macquarie大學的Williams在《Electrophoresis》上首次提出了蛋白質組(proteome)的概念[1]，指由一個基因組、細胞、組織或生物體所表

達的全部蛋白質，是通過生化方法對蛋白質進行大規(guī)模研究的科學[2]。蛋白質組學（Proteomics）是以細胞或組織不同時間、不同環(huán)境下所有的蛋白質為研究對象，從整體上研究蛋白質的種類、功能結構以及相互作用的一門科學，其強調(diào)蛋白質數(shù)量與類型在不同時間和條件下的動態(tài)本質，從而在細胞和生命有機體的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質和活動規(guī)律。其研究領域包括三個方面:①蛋白質大規(guī)模鑒定和轉錄后修飾的微特征研究；②差異顯示蛋白質組學,即對腫瘤等疾病有廣泛應用前景的蛋白質表達水平的比較；③應用質譜技術和酵母雙雜交體系對蛋白質間相互作用的研究。蛋白質組學是專門研究細胞內(nèi)全部蛋白的動態(tài)表

達，包括功能基因組學中所指的全部蛋白，而且還包含一部分非基因組編碼的蛋白，如病毒中的蛋白（其不是由基因組編碼），所以通常也稱之為功能基因組學(functionalgenomics)。Strohman等[3]的研究表明,僅有2%的疾病與基因序列有關,而98%的疾病與蛋白質的表達有關。所以，基因組的研究必定要發(fā)展到蛋白質組研究，才能真正有助于闡明生命活動的本質。隨著科技的發(fā)展，蛋白質組學在中醫(yī)藥科學研究中的應用越來越多。本文通過對蛋白質組學在中藥研究中的應用進行了基礎研究和總結，為今后中藥蛋白質組學的研究者提供思路。1中藥的蛋白質組學的研究對象中藥的蛋白質組學研究的對象為中藥及用中藥（單體化合物、中藥組分或復方）處理后的生物體（細胞或組織）。2常用的蛋白質組學技術2.1蛋白質分離技術雙向凝膠電泳(two-dimensional-gel-ectrophoresis,2-DE)[4],

一種經(jīng)典的蛋白質分離技術，由O’Farrell等[5]于1975年首先創(chuàng)立，是蛋白質組學研究的核心技術。其基本原理:第一項基于蛋白質的等電點不同在pH梯度膠內(nèi)進行等電聚焦(Isoelectricfocusing)；第二項則根據(jù)分子量的大小不同進行SDS分離，把復雜蛋白質混合物中的蛋白質在二維平面上分開。但由于生物樣品中如蛋白質大小的動態(tài)范圍及表達量豐度的區(qū)別等蛋白質表達水平的差異，以及雙向電泳技術對某些蛋白質的“偏性”，極大的限制了其應用的范圍[6-8]。因此，發(fā)展了更多的蛋白質分離技術，如色譜分離技術、毛細管電泳技術、毛細管色譜技術、微流控芯片(Chip)

技術等。2.2質譜技術質譜(Massspectrometry，MS)

是測定同位素峰的儀器，是質量篩選和分析器，通過檢測無機或者有機化合物的質荷比(m/z)

對物質進行定性定量。質譜具有適用于多種化合物、高選擇性分析，重復性好，檢測靈敏度在納克以下，線性范圍寬[9]等優(yōu)勢，是目前最常用的，也是最主要的蛋白質鑒定技術。2.3蛋白質相互作用技術在體內(nèi)，蛋白質幾乎不單獨執(zhí)行它們的獨立功能，已經(jīng)證明80%的蛋白沒有單獨執(zhí)行功能，而是形成蛋白復合物發(fā)揮作用[10]。蛋白質互作(PPI)及其構建的作用網(wǎng)絡在生命活動中發(fā)揮著極其重要的作用[11]，如細胞信號的轉導和調(diào)控、代謝途徑和大分子結構的形成等[12]。包括酵母雙雜交技術、串聯(lián)親和化技術、免疫共沉淀技術、GSTPull-down技術、熒光共振能量轉移和表面等離子共振分析技術等。2.4蛋白質芯片蛋白質芯片技術是基因芯片技術發(fā)展的產(chǎn)物[13]，指將微量蛋白質固定于固相載體，通過高靈敏度讀取系統(tǒng)對樣品溶液進行分析的技術[14]，它能夠同時檢測實驗中微量樣品大量不同的參數(shù)，具有高通量性、敏感性、可重復性、穩(wěn)定性和自動化的特點，可用于蛋白質表達譜分析、研究蛋白質間的相互作用、描述抗體特性、監(jiān)測自身免疫性疾病的特異抗原、進行藥物篩選等[15]。3蛋白質組學在中藥研究中的應用以疾病為基礎，經(jīng)過中藥體系的治療，再通過蛋白質組學技術研究中藥作用機制的研究思路是蛋白質組學在中藥研究中的通用思路。以往的研究表明，蛋白質組學在中藥研究中的應用主要有5個方面：①通過比較中藥不同產(chǎn)地，野生與栽培，不同組分等蛋白質組表達譜的差異，研究中藥藥用功能的機制；②通過比較正常狀態(tài)、病理狀態(tài)以及通過單味藥和復方藥提取物治療后蛋白質組表達譜的差異，尋找可能的相關靶點蛋白；③通過生物信息學方法預測中藥單體化合物與特異性靶點的相互作用，再利用BIAcore生物大分子相互作用儀對中藥單體化合物進行體外相互作用的篩選及驗證；④通過比較蛋白質組學的結果，結合在蛋白質相互作用數(shù)據(jù)庫中與中藥相互作用的蛋白信息，利用生物信息學技術繪制出與中藥作用相關的蛋白質相互作用網(wǎng)絡，并對特異性靶點運用生物學的實驗手段(

如酵母雙雜交，免疫共沉淀，基因過表達及基因敲除技術)

對蛋白質相互作用信號網(wǎng)絡進行驗證；⑤比較中藥體系對疾病治療后的蛋白修飾譜，如組蛋白乙?；揎椬V，泛素化修飾譜等，研究中藥體系對于靶點蛋白的修飾作用。3.1基于蛋白質組學的中藥鑒定研究中藥蛋白質組學指紋圖譜能提供量效相關信息，起到鑒定和研發(fā)的雙重作用，比較不同蛋白質指紋圖譜體現(xiàn)的不同藥效結果，就可確定該制劑的最佳成分配伍，這對于中成藥的二次開發(fā)和中藥新藥的研制有顯著的意義。Lum

等[17]利用2-DE研究了西洋參主根、人參不同取材部位（主根、側根、蘆頭、表皮）以及組織培養(yǎng)野生人參細胞的蛋白質表達譜，結果顯示不同參樣本的2-DE

圖譜（指紋譜）顯著不同，能夠輕易地分辨開來，而傳統(tǒng)的基于色譜和分析鑒定技術卻達不到這一效果。李春梅等[18-19]應用激光解析/離子化-飛行時間質譜技術(SELDI-TOFMS)對傳統(tǒng)中藥龜甲膠、阿膠蛋白/肽成分進行蛋白質組初步分析，分別獲得的有意義蛋白/肽共計6.9

個。通過分析建立龜甲膠、阿膠蛋白質/肽成分質量指紋圖，可作為龜甲膠、阿膠數(shù)字化質控標準；并為進一步分離、純化及驗證龜甲膠、阿膠功能相關活性蛋白質/肽成分提供可靠信息。3.2基于蛋白質組學的中藥質量評價研究蛋白質組學技術的應用，使我們能通過對用藥前后組織或細胞的差異蛋白質組展示來評價中藥的藥效，而且可以針對其中特異表達或差異表達顯著的蛋白點進行更深一步的后續(xù)質譜鑒定研究，確定藥物作用的靶蛋白，這種全景式分析研究方法必將大大加速中藥活性篩選過程。張萃等[20]通過內(nèi)毒素誘導的炎癥細胞模型，從丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、鹽酸川芎嗪、阿魏酸、姜黃素、莪術油中篩選抗炎活血化瘀中藥單體，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA對內(nèi)毒素誘導的炎癥細胞模型有明顯抑制作用，雙向電泳圖象分析篩選出差異性明顯的蛋白質點26個。模型組有16個蛋白點增高，丹參酮ⅡA能使其中的13個蛋白點下調(diào)（占50%），3個進一步上調(diào)（占11.5%）；而對模型組表達下調(diào)的10個蛋白點，丹參酮ⅡA對其均有不同程度上調(diào)趨勢。故內(nèi)毒素感染的細胞模型適合實驗室小劑量中藥單體的篩選，丹參酮ⅡA的抗炎作用與這些差異表達蛋白質有關，能夠調(diào)節(jié)一些蛋白質的表達。3.3基于蛋白質組學的中藥藥理研究王勇等[21]采用雙向凝膠電泳和基質輔助激光解析/電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF)

初步發(fā)現(xiàn)中華小型豬心肌缺血血瘀證模型存在的差異蛋白主要是氧化應激蛋白及相關的心肌結構蛋白，包括熱休克蛋白27(HSP27)

、過氧化物酶(peroxiredoxin3isoform

1)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌球蛋白(myosinlightpolypeptide)，為臨床冠心病心肌缺血血瘀證藥物治療提供可能的靶標。戰(zhàn)麗彬等[22]通過雙向凝膠電泳分離脾陰虛證大鼠海馬蛋白質組初步篩選出脾陰虛大鼠海馬蛋白質組的差異表達，發(fā)現(xiàn)脾陰虛組海馬蛋白質組中有6個明顯的差異蛋白點，其中5個蛋白點表達明顯下調(diào)，1個表達顯著上調(diào)，并推測這些差異表達與學習記憶相關。3.4蛋白組學在中藥代謝調(diào)控中的應用植物各組織（器官）和細胞器中的許多蛋白在植物生長發(fā)育過程中發(fā)生變化。大部分中藥材中含有與光合作用、代謝、細胞分裂、成熟相關的蛋白質。通過對這些蛋白質的比較研究，可掌握藥用資源生物生長成熟過程中與可利用物質相關的蛋白質的變化規(guī)律，可為從分子水平對藥用資源生物可利用物質生物合成進行定向調(diào)控提供依據(jù)。Dong等[24]發(fā)現(xiàn)，在成熟過程中蛋白質組學多態(tài)性在毛毛蟲體內(nèi)和冬蟲夏草基質中呈動態(tài)變化。毛孢(HS)和蝙蝠蛾擬青霉(PH)蛋白質組學多態(tài)性與冬蟲夏草不同，這表明，在成熟過程中與冬蟲夏草相關的真菌和多種冬蟲夏草基因型存在差異蛋白表達。章燕珍[25]應用紫外線B波(UV-B)誘導技術對活體闊葉十大功勞葉進行紫外誘導及相關蛋白質組學分析。通過對6hUV-B照射、不同時間培養(yǎng)后的指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)闊葉十大功勞中次生代謝產(chǎn)物有顯著的變化。與對照組相比，藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀和小檗堿分別增加了919.6%、391.4%、192.4%和33.1%。通過基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)鑒定，普通雙向電泳得到了13個差異點，利用組合肽配體庫技術后，檢測到了91個新蛋白點，同時異喹啉生物堿合成的6個關鍵酶基因經(jīng)誘導后也顯著提高。3.5利用蛋白質組學尋找中藥作用相關靶點蛋白3.5.1中藥單體化合物作用相關靶點蛋白的尋找2003年，MacKeigan等[26]通過蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑和紫杉醇(paclitaxel/taxol)合用時改變了RhoGDIα(RhoGDP-dissociationinhibitorα)和RS/DJ-1(RNA-bindingregulatorysubunit/DJ-1PARK7)蛋白的表達；2005年，Lee

等[27]利用蛋白質組學的方法研究了紫杉醇作用于人宮頸癌HeLa細胞可能的靶點蛋白；2010年，Cui等[28]運用蛋白質組學技術研究了中藥靈芝單體化合物9,11-dehydroergosterolperoxide對于人宮頸癌HeLa細胞毒性的作用機制。3.5.2中藥復方提取物作用相關靶點蛋白的尋找2006年，Liu

等[29]研究了由熟地黃、當歸、白芍和川芎4味中藥組成的四物湯對于由環(huán)磷酰胺導致的血虛證小鼠骨髓蛋白質組的影響，結果發(fā)現(xiàn)四物湯可能通過影響與細胞凋亡和造血祖細胞增殖分化相關的蛋白，進而促進骨髓造血；2009年，Lee等[30]考察了由茵陳蒿、大黃和梔子等中藥組成的復方茵陳蒿湯(Yin-Chen-Hao-Tang)作用于由膽管結扎造成的肝纖維化模型大鼠27d后肝臟蛋白質組的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯治療大鼠肝纖維化的作用機制可能與調(diào)控脂類物質的生物合成抑制以及正常肝細胞的凋亡有關。2012年，Yue等[31]通過蛋白質組學技術考察了丹參多酚酸和三七總皂苷聯(lián)合應用對于心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用。3.6中藥直接結合靶點蛋白的預測和驗證利用分子對接技術高通量篩選中藥單體化合物，再通過體內(nèi)外實驗驗證中藥單體的藥效是目前尋找中藥有效成分的較好的一種高通量藥物篩選方式。這種藥物篩選方式依靠日益完善的蛋白質空間結構數(shù)據(jù)庫，常用的蛋白質空間結構數(shù)據(jù)庫有PDB、MMDB、ISSD、CATH、SCOP

等；其中，PDB(proteindatabank)數(shù)據(jù)庫是目前收錄最為詳盡的蛋白質結構數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含了通過X

射線晶體衍射和磁共振獲得的蛋白質三維結構數(shù)據(jù)。PDB

數(shù)據(jù)庫由美國Brookhaven實驗室于1971年建立[32]，收錄了通過X射線晶體衍射、核磁共振和電子顯微鏡方法測定的生物大分子的三維結構。分子對接技術包括正向對接及反向對接，正向對接是指通過蛋白質的空間結構搜索與其特異性結合的小分子，而反向對接則是根據(jù)其提供的蛋白質空間結構采用小分子配體搜索潛在結合蛋白的方法，2種技術都可以預測中藥單體化合物與靶點蛋白的相互作用。目前用于分子對接的軟件有DiscoveryStudio，AutoDock，Surflex，F(xiàn)lexX，MVD，INVDOCK等。Yue

等采用反向對接軟件(INVDOCK)尋找能夠分別與靈芝酸D和丹酚酸B直接結合的靶點蛋白，結果表明，14-3-3蛋白可能是靈芝酸D直接結合的靶點蛋白[33]，而EGFR蛋白可能是丹酚酸B直接結合的靶點蛋白[34]。然而分子對接的實驗結果必須利用實驗技術來驗證，常用的實驗驗證手段包括體外細胞實驗，Elisa試劑盒驗證以及采用BIAcore生物大分子相互作用儀通過體外表面等離子體共振技術對中藥單體化合物與靶點蛋白的結合活性進行驗證[35]。3.7中藥相關靶點蛋白相互作用信號網(wǎng)絡的繪制和驗證隨著蛋白質相互作用研究技術的發(fā)展，目前已經(jīng)獲得了大量的蛋白質相互作用數(shù)據(jù)，如BIND數(shù)據(jù)庫(http://bind.ca/)、DIP數(shù)據(jù)庫(http://dip.doe-mbi.U/)和STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.emb1.de/)。例如，2011年Feng[36]和Ma

等[37]分別采用該方法繪制了丹酚酸B

的靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡結構。而對于網(wǎng)絡結構中的一些關鍵蛋白，可以采用基因敲除或過表達的方式來驗證其相互作用。對于網(wǎng)絡中一些預測的中間蛋白，可以采用生物學實驗，如RNA干擾、基因過表達等，進行深入研究。繪制靶點作用網(wǎng)絡的方法特別適合中藥的研究；最新的研究理