密級(jí)：JININGUNIVERSITY學(xué)士學(xué)位論文THESISOFBACHELOR題 目 黃酮類天然物地提取分離工藝探究系 別： 化學(xué)與化工系專業(yè)年級(jí)： 化學(xué)師范2018級(jí)學(xué)生姓名： 李燦燦 學(xué)號(hào)： 2018084113指導(dǎo)教師： 周芳霞 職稱： 講師起訖日期： 2018年3月6日－2018年5月15日目錄33Abstract4Keywords4515252.152.262.2.162.262.2.372.2.472.2.582.2.682.2.792.3103103.1103.2113.3123.3.1123.3.2123.4123.4.1123.4.1.1<123.4.1.2<133.4.2133.4.2.1123.4.2.2133.4.2.3133.4.2.4133.4.2.5143.4.2.614b5E2RGbCAP3.4.3143.4.414154.1154.2154.3154.4154.5165165.1165.1.1(>165.1.2165.1.31 6

p 1 E a n q F D P w5.2165.2.1165.2.2175.2.3175.2.4175.2.5175.2.6185.2.7186186.1pH186.2(HPLC>196.3196.4196.4.1196.4.2196.4.3(Sephadexgel>206.4.4207202123黃 酮 類 天 然 物 地 提 取 分 離 工 藝 探 究摘要：黃酮類化合物是一類具有廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景地天然藥物 ,文章主要綜述了近幾年來(lái)不同地提取和分離方法在黃酮類化合物中地應(yīng)用進(jìn)展 .隨著科技地進(jìn)步 ,黃酮類化合物地提取和分離方法將更加快速、高效、完善 .黃酮類化合物具有廣泛地生理功能 ,是許多中草藥地有效成分, 具有很高地藥用價(jià)值 ,黃酮類化合物還在食品、化妝品等行業(yè)中廣泛應(yīng)用 .隨著市場(chǎng)需求量地增加 ,經(jīng)濟(jì)效益地提高 , 黃酮類化合物提取和分離方法也在不斷地改進(jìn)和提高.DXDiTa9E3d關(guān)鍵詞:黃酮類化合物 提取 分離 應(yīng)用ResearchprocessofextractionandseparationofflavonoidsofnaturalproductsRTCrpUDGiTStudentmajoringinChemistry LicancanTutorZhoufangxiaAbstract：Flavonoidsareakindofnaturaldrugwhichhaswideapplicationforeground,thepapersummarizedtheprogressofextractionandseparationmethodsinrecentyearsindifferentflavonoids.Withtheprogressofscienceandtechnology,extractionandseparationmethodsofflavonoidswillbemorequick,efficient,complete.Flavonoidshaveawiderangeofphysiologicalfunctions,istheeffectiveingredientsinmanyChineseherbalmedicine,ithasveryhighmedicinalvalue,widelyusedinfood,cosmetics,flavonoidsandotherindustries.Withtheincreaseinmarketdemand,improvetheeconomicbenefitsofflavonoidcompounds,extractionandseparationmethodsareconstantlyimprovedandtoimprove.5PCzVD7HxAKeyWords:FlavonoidsExtractionSeparationApplicationjLBHrnAILg引言黃酮類化合物是廣泛存在于自然界地一大類化合物 ,是色原烷地衍生物,其特點(diǎn)是具有C6—C3—C6地基本骨架,并可根據(jù)中間吡喃環(huán)地不同氧化水平和兩側(cè)A、B環(huán)上連接地各種取代基,而分為不同地黃酮類型[1],屬于植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生地一些次級(jí)代謝產(chǎn)物 .已知化學(xué)結(jié)構(gòu)地黃酮類物質(zhì)至少有 4000余種.主要存在于植物地葉、果實(shí)、根、皮中 ,實(shí)驗(yàn)證明其具有廣泛地生理和藥理活性,因此對(duì)該化合物地研究已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界研究地?zé)衢T(mén)話題 ,是一類具有廣泛開(kāi)發(fā)前景地天然藥物 [2],在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域均有巨大 地應(yīng)用前景[3].xHAQX74J0X黃酮類化合物具有廣泛地生理功能 ,是許多中草藥地有效成分 , 具有很高地藥用價(jià)值, 如有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用 [4,5].黃酮類化合物還在食品、化妝品等行業(yè)中廣泛應(yīng)用 . 隨著市場(chǎng)需求量地增加,經(jīng)濟(jì)效益地提高, 黃酮類化合物提取和分離方法也在不斷地改進(jìn)和提高 .LDAYtRyKfE黃酮類化合物簡(jiǎn)介黃酮類化合物<flavonoids ）,又稱生物類黃酮<bioflavonoids ）,是指具有色酮環(huán)與苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)地一類化合物地總稱 ,是多酚類化合物中最大地一個(gè)亞類.其基本骨架具有C6-C3-C6地特點(diǎn),即由2個(gè)芳香環(huán)A和B,通過(guò)中央三碳鏈相互連結(jié)而成地一系列化合物 .根據(jù)間三碳鏈地氧化程度、 B環(huán)<苯基）連接位置<2-或3-位）以及三碳鏈?zhǔn)欠癯虱h(huán)狀等特點(diǎn) ,黃酮類化合物分為許多不同類型 ,如黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查爾酮等 <葉文峰,2000）.自然界中最常見(jiàn)地是黃酮和黃酮醇,在銀杏葉、山楂、杜仲、山香圓葉、水芹、竹葉、黃芪、丹參等植物中均有檢出.黃酮類化合物在人體不能直接合成,只能從食品中獲得.主要是作為食品添加劑或直接應(yīng)用于食品中增加其保健作用.正是黃酮類化合物上述生物活性和藥理作用引起了人們地廣泛重視,對(duì)該類化合物地研究已成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界研究地?zé)衢T(mén)課題.黃酮類物質(zhì)已成為一類具有廣泛開(kāi)發(fā)前景地天然藥物.Zzz6ZB2Ltk黃酮類化合物地分類2.1 定義凡兩個(gè)苯環(huán)<A環(huán)、B環(huán)）通過(guò)三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成地一類成分稱為黃酮類化合物.大多具有6C-3C-6C地基本骨架,且常有羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等取代基.dvzfvkwMI1812'3'7O21'B4'AC636'5'542.2 黃酮苷元地結(jié)構(gòu)和分類根據(jù)B環(huán)連接位置<2為或3為）、C環(huán)氧化程度、C環(huán)是否成環(huán)等將黃酮類化合物分為以下幾大類[6,7].2.2.1 黃酮和黃酮醇ORO

R=H 黃酮R=OH黃酮醇這里指地是狹義地黃酮,即2－苯基色原酮<2-苯基苯并 γ吡喃酮）類,此類化合物數(shù)量最多,尤其是黃酮醇.如芫花中地芹菜素、金銀花中地木犀草素屬于黃酮類；銀杏中地山奈素和槲皮素[8]屬于黃酮醇類.rqyn14ZNXIOHHO O OH OOH OHOH O OH O芹菜素 木犀草素OHOH O OH OOH OHOH OHOH O OH O山奈素 槲皮素2．2.2 二氫黃酮和二氫黃酮醇ORO

R=H 二氫黃酮R=OH二氫黃酮醇與黃酮和黃酮醇相比,其結(jié)構(gòu)中C環(huán)C2-C3位雙鍵被飽和,他們?cè)谥参矬w內(nèi)常與相應(yīng)地黃酮和黃酮醇共存 .如甘草中地甘草素、橙皮中地橙皮苷均屬于二氫黃酮類；滿山紅中地 二氫槲皮素、桑枝中地二氫桑色素均 屬于二氫黃酮醇類.EmxvxOtOcoOHOHOOHOOCH2OOHCH3OOOCH3OHOHOHOHOHOOOH甘草素橙皮苷OHHOOHOOHOOHOHOHOHOHOOHO二氫槲皮素 二氫桑色素2.2.3 異黃酮和二氫異黃酮異黃酮類為具有 3－苯基色原酮基本骨架地化合物 ,與黃酮相比其 B環(huán)位置連接不同.如葛根中地葛根素、大豆苷及大豆素均為異黃酮 .SixE2yXPq51R2OO大豆素R1=R2=R3=HOR3大豆苷R=R=HR2=glc葛根素13R=R=HR1=glc23O6ewMyirQFL二氫異黃酮類可看作是異黃酮類 C2和C3雙鍵被還原成單鍵地一類化合物 .如中藥廣豆根中地紫檀素就屬于二氫異黃酮地衍生物 .kavU42VRUsCH3O OO紫檀素

OO2.2.4 查耳酮和二氫查耳酮類查耳酮地主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是C環(huán)未成環(huán),另外定位也與其他黃酮不同.其可以看作是二氫黃酮在堿性條件下C環(huán)開(kāi)環(huán)地產(chǎn)物,兩者互為同分異構(gòu)體,常在植物體內(nèi)共存.同時(shí)兩者地轉(zhuǎn)變伴隨著顏色地變化.y6v3ALoS89二氫查耳酮在植物界分布極少 .O OHOH-+O O二氫黃酮 2-羥基查耳酮中藥紅花中地紅花苷為查耳酮類 .紅花在開(kāi)花初期時(shí),花中主要成分為無(wú)色地新紅花苷<二氫黃酮類）及微量紅花苷 ,故花冠是淡黃色；開(kāi)花中期花中主要成分為黃色地紅花苷,故花冠為深黃色；開(kāi)花后期則變成紅色地醌式紅花苷 ,故花冠為紅色.M2ub6vSTnPHOOHOOHHOOOHOHOH異構(gòu)化氧化酶HOHOSO2OglcOOglcOOglcOO新紅花苷

(無(wú)色>

紅花苷

(黃色>

醌式紅花苷

(紅色>0YujCfmUCw2.2.5橙酮類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：可看作是黃酮地C環(huán)分出一個(gè)碳原子變成五元環(huán),其余部位不變,但C原子定位也有所不同.是黃酮地同分異構(gòu)體,屬于苯駢呋喃地衍生物,又名噢哢.如黃花波斯菊花中含有地硫磺菊素就屬于此類.eUts8ZQVRd712'3'HO71OO2'3'621'4'621'ACHBCH4'5536'5'4436'5'OO橙酮基本結(jié)構(gòu)硫磺菊素2.2.6 花色素和黃烷醇類O O+色原烯

2-苯基色原烯

(

花色素母核

>花色素類是一類以離子形式存在地色原烯地衍生物

.

廣泛存在于植物地花、果、葉、莖等部位

,是形成植物藍(lán)、紅、紫色地色素

.由于花色素多以苷地形式存在,故又稱花色苷.如矢車菊素、飛燕草素、天竺葵素等屬于此類.sQsAEJkW5TR1HOO+飛燕草素R1=R2=OHOHOHR2矢車菊素R1=OHR2=H天竺葵素R=R=HOH12黃烷醇類生源上是由二氫黃酮醇類還原而來(lái),可看成是脫去C4位羰基氧原子后地二氫黃酮醇類.OOH黃烷-3-

醇黃烷-3-

醇在植物界分布很廣

,如<+）兒茶素

(catechin>

和<–）表兒茶素(epicatechin

）.故又稱為兒茶素類

.兒茶素為中藥兒茶地有效成分

,具有一定地抗癌活性

.GMsIasNXkAOH

OHH

HHO

O

HO

OOH

OHH

OHOH

HOH

OH<+）兒茶素 <-）表兒茶素2.2.7 其他黃酮類此類化合物大多不符合 C6-C3-C6地基本骨架,但因具有苯并γ-吡喃酮結(jié)構(gòu),我們也將其歸為黃酮類化合物 .TIrRGchYzg雙黃酮類：是由二分子黃酮衍生物通過(guò) C-C鍵或C-O-C鍵聚合而成地二聚物.如銀杏葉中含有地銀杏素即為 C-C鍵相結(jié)合地雙黃酮衍生物 .7EqZcWLZNXCH3O OOCH3HO OOH O OHOH O銀杏素高異黃酮：和異黃酮相比,其B環(huán)和C環(huán)之間多了一個(gè)—CH2—,如中藥麥冬中存在地麥冬高異黃酮A(ophiopogononeA>.lzq7IGf02EHOOOHOOO麥冬高異黃酮A呋喃色原酮：即色原酮地 C6—C7位并上一個(gè)呋喃環(huán).如凱刺種子和果實(shí)中得到地凱林屬于此類.OCH3O O CH3OCH3O凱林苯色原酮：即色原酮地 C6—C7位并上一個(gè)苯環(huán).如決明子中含有地紅鐮酶素屬于此類.HO O CH3OCH3OH O紅鐮酶素2.3 黃酮苷地糖地結(jié)構(gòu)分類天然黃酮類化合物多以苷類形式存在,并且由于糖地種類、數(shù)量、聯(lián)接位置及聯(lián)接方式不同,可以組成各種各樣地黃酮苷類.組成黃酮苷地糖類主要有：zvpgeqJ1hk單糖類；D－葡萄糖、D－半乳糖、D－木糖、L－鼠李糖、L－阿拉伯糖及D－葡萄糖醛酸等.雙糖類：槐糖<glc1-2glc）.龍膽二糖<glC1-6glc）、答香糖<rha1-6glc）、新橙皮糖<rha1－6glC）、刺槐二糖<rha1－6gal等.NrpoJac3v1三糖類：龍膽三糖 <glc1－6glc1－2fru）、槐三糖<glc1－2glc1－2glc）等.?；穷?；2－乙酰葡萄糖、咖啡酰基葡萄糖等 .黃酮類化合物地性質(zhì)3.1 性狀黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體 ,少數(shù)<如黃酮苷類）為無(wú)定形粉末 .游離地各種苷元母核中,除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷醇有族光性外,其余則無(wú)光學(xué)活性.苷類由于在結(jié)構(gòu)中引入糖地分子,故均有旋光性,且多為左旋.黃酮類化合物地顏色與分子中是否存在交叉共軛體系及助色團(tuán) <－OH、－OCH3等）地種類、數(shù)目以及取代位置有關(guān).以黃酮為例,其色原酮部分原本元色；但在2位上引入苯環(huán)后,即形成交叉共軛體系,并通過(guò)電子轉(zhuǎn)移、重排,使共軛鏈延長(zhǎng),因而顯現(xiàn)出顏色.一般情況下,黃酮、黃酮醇及其苷類多顯灰黃～黃色 ,查耳酮為黃～橙黃色,而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類,因不具有交叉共軛體系或共軛鏈短,故不顯色<二氫黃酮及二氫黃酮醇）或顯微黃色<異黃酮）.顯然,在上述黃酮、黃酮醇分子中,尤其在7位及4′位引入－OH及－OCH3等助色團(tuán)后,則因促進(jìn)電子移位、重排,而使化合物地顏色加深.但－OH、－OCH3,引入其他位置則影響較小.1nowfTG4KI花色素及其苷元地顏色隨 pH不同而改變,一般顯紅<pH＜7）、紫<pH＝8.5）藍(lán)<pH＞8.5）等顏色.fjnFLDa5Zo3.2 溶解性黃酮類化合物地溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)<苷和苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷）不同而有很大差異.一般游離苷元難溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醇等有機(jī)溶劑及稀堿水溶液中.其中黃酮、黃酮醇、查耳酮等平面性強(qiáng)地分子,因分子與分子間排列緊密,分子間引力較大,故更難溶于水；而二氫黃酮及二氫黃酮醇等,因系非平面性分子,故分子與分子間排列不緊密,分子間引力降低,有利于水分子進(jìn)入,溶解度稍大.tfnNhnE6e5至于花色苷元<花青素）類雖也為平面性結(jié)構(gòu),但因以離子形式存在,具有鹽地通性,故親水性較強(qiáng),水中溶解度較大.HbmVN777sL黃酮類苷元分子中引入羥基,將增加在水中地溶解度；而羥基經(jīng)甲基化后,則增加在有機(jī)溶劑中地溶解度.例如,一般黃酮類化合物不溶于石油醚中,故可與脂溶性雜質(zhì)分開(kāi),但川陳皮素<5,6,7,8,3′,4′－六甲氧基黃酮）卻可溶于石油醚.V7l4jRB8Hs黃酮類化合物地羥基糖苷化后 ,水中溶解度即相應(yīng)加大 ,而在有機(jī)溶劑中地溶解度則相應(yīng)減小.黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑中；但難溶或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中 .糖鏈越長(zhǎng),則水中溶解度越大.83lcPA59W9另外,糖地結(jié)合位置不同 ,對(duì)苷地水中溶解度也有一定影響：以棉黃素<3,5,7,8,3 ′,4′－六羥基黃酮）為例 ,其3－O－葡萄糖苷地水中溶解度大于 7O－葡萄糖苷.mZkklkzaaP3.3 酸性與堿性3.3.1 酸性黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基 ,故顯酸性,可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中 .由于酚羥基數(shù)目及位置不同 ,酸性強(qiáng)弱也不同,以黃酮為例,其酚羥基酸性強(qiáng)弱順序依次為：7,4 ′－二羥基＞7或4′－羥基＞一般酚羥基＞ 5－羥基例如C7－OH因?yàn)樘幱贑＝O地對(duì)位,在p－共軛效應(yīng)地影響下,酸性較強(qiáng),可溶于碳酸鈉水溶液中,此性質(zhì)可用于提取、分離及鑒定工作.AVktR43bpw3.3.2 堿性－吡喃環(huán)上地1位氧原子,因有未共用地電子對(duì),故表現(xiàn)微弱地堿性,可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸,如濃硫酸、鹽酸等生成鹽,但生成地樣鹽極不穩(wěn)定,加水后即可分解.ORjBnOwcEd黃酮類化合物溶于濃硫酸中生成地樣鹽,常常表現(xiàn)出特殊地顏色,可用于鑒別.某些甲氧基黃酮溶于濃鹽酸中顯深黃色,且可與生物堿沉淀試劑生成沉淀.2MiJTy0dTT3.4 顯色反應(yīng)黃酮類化合物地顏色反應(yīng)多與分子中地酚羥基及 γ～吡喃酮環(huán)有關(guān).3.4.1還原實(shí)驗(yàn)3.4.1.1鹽酸－鎂粉<或鋅粉）反應(yīng)這是鑒定黃酮類化合物最常用地顏色反應(yīng).方法是將樣品溶于1．0ml甲醇或乙醇中,加入少許鎂粉<或鋅粉）振搖,滴加幾滴濃鹽酸,1～2min內(nèi)<必要時(shí)微熱）即可顯色.多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅至紫紅色.少數(shù)顯紫至藍(lán)色,當(dāng)B環(huán)上有－OH或－OCH3取代時(shí),呈現(xiàn)地顏色隨之加深 .但查耳酮、橙酮、兒茶素類則無(wú)該顯色反應(yīng) .異黃酮類除少數(shù)例外 ,也不顯色.gIiSpiue7A由于花青素及部分橙酮、查耳酮等在單純濃鹽酸中也會(huì)發(fā)生色變 ,故須預(yù)先作空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)<在供試液中僅加入濃鹽酸進(jìn)行觀察） .uEh0U1Yfmh另外,在用植物粗提取液進(jìn)行預(yù)試時(shí) ,為了避免提取液本身顏色地干擾 ,可注意觀察加入濃鹽酸后升起地泡沫顏色 .如泡沫為紅色,即示陽(yáng)性.IAg9qLsgBX鹽酸－鎂粉反應(yīng)地機(jī)理過(guò)去解釋為由于生成了花色苷元所致 ,現(xiàn)在認(rèn)為是因?yàn)樯闪岁?yáng)碳離子緣故.3.4.1.2 四氫硼鈉<鉀）反應(yīng)N aBH4是對(duì)二氫黃酮類化合物專屬性較高地一種還原劑 .與二氫黃酮類化合物產(chǎn)生紅至紫色.其他黃酮類化合物均不顯色 ,可與之區(qū)別.方法是在試管中加入0.1ml含有樣品地乙醇液 ,再加等量2％NaBH4地甲醇液,lmin后,加濃鹽酸或濃硫酸數(shù)滴,生成紫色至紫紅色.WwghWvVhPE另外,近來(lái)報(bào)道二氫黃酮可與磷鉬酸試劑反應(yīng)呈現(xiàn)棕褐色 ,也可作為二氫黃酮類化合物地特征鑒別反應(yīng) .3.4.2 金屬鹽類試劑地絡(luò)合反應(yīng)黃酮類化合物中常含有下列結(jié)構(gòu)單元 ,故?？膳c鋁鹽、鉛鹽、諸鹽、鎂鹽等試劑反應(yīng),生成有色絡(luò)合物.3.4.2.1 鋁鹽常用試劑為1％三氯化鋁或硝酸鋁溶液 .生成地絡(luò)合物多為黃色,并有熒光,可用于定性及定量分析.3.4.2.2 鉛鹽常用工％醋酸鉛及堿式醋酸鉛水溶液 ,可生成黃至紅色沉淀.黃酮類化合物與鉛鹽生成沉淀地色澤 ,因羥基數(shù)目及位置不同而異 .其中,醋酸鉛只能與分子中具有鄰二酚羥基或兼有3－羥基、4－酮基或5－羥基、4－酮基結(jié)構(gòu)地化合物反應(yīng)生成沉淀.但堿式醋酸鉛地沉淀能力要大得多,一般酚類化合物均可與其發(fā)生沉淀,依此不僅可用于鑒定,也可用于提取及分離工作.asfpsfpi4k3.4.2.3鋯鹽多用2％二氯氧鋯甲醇溶液黃酮類化合物分子中有游離地3－或5－羥基存在時(shí),均可與該試劑反應(yīng)生成黃色地鋯絡(luò)合物.但兩種鋯絡(luò)合物對(duì)酸地穩(wěn)定性不同.3－羥基,4－酮基絡(luò)合物地穩(wěn)定性比5－羥基,4－酮基絡(luò)合物地穩(wěn)定性強(qiáng)<僅二氫黃酮醇除外）故當(dāng)反應(yīng)液中接著加入枸椽酸后 ,5－羥基黃酮地黃色溶液顯著褪色,而3－羥基黃酮溶液仍呈鮮黃色<鋯－枸椽酸反應(yīng)）.方法是取樣品0.5～1.0mg,用10.0ml甲醇加熱溶解,加1.0ml2％二氯氧鋯<ZrOCl2）甲醇液,呈黃色后再加入2％枸椽酸甲醇溶液,觀察顏色變化.ooeyYZTjj1上述反應(yīng)也可在紙上進(jìn)行 ,得到地鋯鹽絡(luò)合物多呈黃綠色 ,并帶熒光.3.4.2.4 鎂鹽常用醋酸鎂甲醇溶液為顯色劑,本反應(yīng)可在紙上進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)時(shí)在紙上滴加一滴供試液,噴以醋酸鎂地甲醇溶液,加熱干燥,在紫外光燈下觀察.二氫黃酮、二氫黃酮醇類可顯天藍(lán)色熒光 ,若具有C3-OH,色澤更為明顯.而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃－橙黃－褐色 .BkeGuInkxI3.4.2.5 氯化鍶<SrCl2）在氨性甲醇溶液中,氯化鍶可與分子中具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)地黃酮類化合物生成綠色至棕色乃至黑色沉淀 .具有鄰二酚羥基地黃酮類化合物與SrCl2地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí),取約1.0mg檢品置小試管中,加入1.0ml甲醇使溶<必要時(shí)可在水浴上加熱）,加入3滴0.01mol／L.氯化鋁地甲醇溶液,再加3滴已用氨蒸氣飽和地甲醇溶液,注意觀察有無(wú)沉淀生成.PgdO0sRlMo3.4.2.6 三氯化鐵三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用地酚類顯色劑.多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基,故可產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng),但一般僅在含有氫鍵締合地酚羥基時(shí),才呈現(xiàn)明顯反應(yīng).3cdXwckm153.4.3 硼酸顯色反應(yīng)當(dāng)黃酮類化合物分子中有下列結(jié)構(gòu)時(shí),在無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸存在條件下,可與硼酸反應(yīng),生成亮黃色.顯然,5－羥基黃酮及2－羥基查耳酮類結(jié)構(gòu)可以滿足上述要求,故可與其他類型區(qū)別.一般在草酸存在下顯黃色并具有綠色熒光,但在枸椽酸丙酮存在地條件下,則只顯黃色而無(wú)熒光.h8c52WOngM3.4.4 堿性試劑顯色反應(yīng)在日光及紫外光下,通過(guò)紙斑反應(yīng),觀察樣品用堿性試劑處理后地顏色變化情況,對(duì)于鑒別黃酮類化合物有一定意義.其中,用氨蒸氣處理后呈現(xiàn)地顏色變化置空氣中隨即褪去,但經(jīng)碳酸鈉水溶液處理而呈現(xiàn)地顏色置空氣中卻不褪色.v4bdyGious此外,利用堿性試劑地反應(yīng)還可幫助鑒別分子中某些結(jié)構(gòu)特征 .例如：<1）二氫黃酮類易在堿液中開(kāi)環(huán) ,轉(zhuǎn)變成相應(yīng)地異構(gòu)體－查耳酮類化合物 ,顯橙至黃色.<2）黃酮醇類在堿液中先呈黃色 ,通入空氣后變?yōu)樽厣?因此可與其他黃酮類區(qū)別.<3）黃酮類化合物當(dāng)分子中有鄰二酚羥基取代或3,4′－二羥基取代時(shí),在堿液中不穩(wěn)定,易被氧化,由黃色－深紅色－綠棕色沉淀.J0bm4qMpJ9黃酮類化合物地功能作用4.1 抗氧化、清除氧自由基作用 [9]自由基被認(rèn)為與炎癥、自身免疫病、腫瘤、衰老等疾病地成因有直接關(guān)系 .黃酮類化合物具有清除自由基和抗氧化地能力 ,有人研究了從4種大麥麥葉中提取地黃酮類化合物對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基地清除作用 ,得出隨著黃酮濃度地增加,清除率呈上升趨勢(shì)地結(jié)論 .還有用化學(xué)熒光法對(duì)不同黃酮類化合物進(jìn)行了分析測(cè)定,確定了它們地強(qiáng)抗氧化性 .XVauA9grYP4.2 調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)作用在心臟功能調(diào)節(jié)方面黃酮類化合物主要體現(xiàn)在抗心律失常和改善冠脈循環(huán)方面.在血管功能地調(diào)節(jié)方面,蘆丁能協(xié)同增效維生素C一起降低毛細(xì)血管脆性和通透性,維持毛細(xì)血管穩(wěn)定性.在調(diào)節(jié)血脂血壓方面,山楂黃酮、大豆異黃酮等能降低高脂血癥人群中地血清總膽固醇(TC>、甘油三酯(TG>、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C>含量,并使高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C>含量有一定程度地升高；黃酮類化合物降低血壓主要表現(xiàn)在促進(jìn)一氧化氮(NO>地生成和對(duì)血管平滑肌細(xì)胞異常凋亡地雙向調(diào)節(jié)作用上.在抗血栓方面,黃酮類化合物能改善血液流變性,以及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和黏附分子表達(dá)地影響.黃酮類化合物在調(diào)節(jié)心血管作用方面與其具有良好地抗氧化性是分不開(kāi)地.bR9C6TJscw4.3 抗癌、防癌作用黃酮類化合物抗癌、防癌地作用 [10], 主要是通過(guò)其抗自由基作用、直接抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抗致癌因子、抑制血管生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力而實(shí)現(xiàn).由于生物類黃酮地抗氧化和清除自由基能力,它能有效地阻止脂質(zhì)過(guò)氧化引起地細(xì)胞破壞.田爽等對(duì)染料木黃酮在人卵巢癌細(xì)胞系抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡發(fā)生中地作用進(jìn)行了研究.pN9LBDdtrd4.4 抗炎免疫及抗衰老作用生物類黃酮具有抗炎作用,抗炎機(jī)制可能在于其抑制了前列腺素(PG>生物合成過(guò)程中地脂氧化酶(LOX>.在抗衰老方面,孟憲麗等對(duì)淫羊藿總黃酮對(duì)老年大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌地調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究,證實(shí)淫羊藿總黃酮能提高神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)地整體功能從而抗衰老.DJ8T7nHuGT4.5 對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)地作用主要體現(xiàn)在降血糖作用、激素樣作用和對(duì)骨組織地作用.黃酮類化合物能夠促進(jìn)胰島B細(xì)胞地恢復(fù),降低血糖和血清膽固醇,改善糖耐量,調(diào)節(jié)對(duì)抗腎上腺素地升血糖作用,同時(shí)它還能夠抑制醛糖還原酶作用,因此可以治療糖尿病及其并發(fā)癥.許多黃酮類物質(zhì)因結(jié)構(gòu)與己烯雌酚相似而具有雌性激素樣作用 ,它與甾類激素一樣具有興奮和抑制雙重效應(yīng) ,能提高甲狀腺對(duì)雌激素地敏感性 ,使甲狀腺C細(xì)胞分泌降鈣素地作用加強(qiáng) .QF81D7bvUA生物類黃酮還具有吸收紫外輻射、止咳、祛痰、瀉下、解痙、提高記憶力、抗過(guò)敏、活血化瘀、利膽及肝臟保護(hù)作用等 .4B7a9QFw9h黃酮類化合物提取方法地研究進(jìn)展5.1 按所用溶劑不同分類5.1.1 熱水提取法(以水作溶劑>熱水一般僅限于提取苷類 .在提取過(guò)程中要考慮加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)[11]以水做溶劑,同時(shí)提高浸提溫度、延長(zhǎng)浸提時(shí)間和增加液料比 (60倍>,可以明顯提高蘆丁地產(chǎn)率.ix6iFA8xoX5.1.2 有機(jī)溶劑萃取法乙醇和甲醇是提取黃酮類化合物地最常用溶劑 .高濃地醇(90%～95%>適合提取苷元,60%左右地醇適合提取苷類 ,提取地次數(shù)一般為 2～4次. 胡福良等提取蜂膠液中黃酮類化合物 ,以80%乙醇提取地總黃酮地含量最高 .其他有機(jī)溶劑法是根據(jù)相似相溶原理 ,對(duì)不同性質(zhì)地黃酮選擇最佳地有機(jī)溶劑進(jìn)行提取.wt6qbkCyDE5.1.3 堿提取酸沉淀法黃酮類成分大多具有酚羥基 ,易溶于堿水(如碳酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣水溶液>和堿性稀醇. 因此,可先用堿性水提取 ,堿性提取液加酸后黃酮苷類即可沉淀析出.提取時(shí)應(yīng)控制酸堿地濃度 ,以免在強(qiáng)堿下加熱時(shí)破壞黃酮類化合物地母核.當(dāng)有鄰二酚羥基時(shí)可加硼酸保護(hù) .此方法簡(jiǎn)便易行 ,橙皮苷、黃芩苷、蘆丁等都可用此法提取.Kp5zH46zRk5.2 按提取條件不同分類5.2.1 回流提取法本法是加熱回流提取黃酮類化合物地一種方法 .所用回流劑一般有水、醇及混合溶劑.此法操作簡(jiǎn)便 ,但效率不夠高 ,一般很難一次性完全提出黃酮化合物,需要反復(fù)回流提取.Yl4HdOAA615.2.2 索式提取法該法是用索式提取器,多次提取黃酮,其溶劑可反復(fù)利用,操作方便,價(jià)格低廉且提取效率高,但此法所需時(shí)間較長(zhǎng).索式提取黃酮類化合物地方法已廣泛為人們所利用.ch4PJx4BlI5.2.3 微波輔助提取法該法是利用微波加熱地特性對(duì)成分進(jìn)行選擇性提取地方法.此法具有快速、高效、高選擇性、對(duì)環(huán)境無(wú)危害等特點(diǎn)[12,13].劉峙嶸等采用微波萃取銀杏葉中黃酮類化合物及唐課文等采用微波輔助法從黎蒿中提取黃酮類化合物 ,與傳統(tǒng)溶劑萃取方法相比 ,微波萃取法更簡(jiǎn)單 ,而且具有萃取時(shí)間短、成本低、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn).qd3YfhxCzo5.2.4 超聲提取法該法是利用超聲波浸提黃酮類化合物地一種方法.其基本原理是利用超聲波地空化作用,破壞植物地細(xì)胞,使溶劑易于滲入細(xì)胞內(nèi),同時(shí)超聲波地強(qiáng)烈振動(dòng)能給植物和溶劑傳遞巨大地能量,使它們做高速地運(yùn)動(dòng),加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)地釋放和溶解以及有效成分地浸出,大大提高了提取效率.超聲提取法具有提取時(shí)間短、效率高、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn).劉海鵬等用超聲波提取銀杏葉總黃酮比回流法提取率高,且操作簡(jiǎn)便,節(jié)省時(shí)間,其最佳條件為:提取時(shí)間25min,溫度10℃,連續(xù)提取3次,總黃酮提取率達(dá)96%.霍丹群等[12]在綜合考慮成本等可行性因素下,提取山楂中黃酮類物質(zhì),提取時(shí)間大大縮短,產(chǎn)率較高,且實(shí)驗(yàn)可在室溫下進(jìn)行,設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便.E836L11DO55.2.5 超濾法該法是一種膜分離法,而且是唯一能用于分子分離地過(guò)濾方法,能從周圍地介質(zhì)中分離出100～1000nm地微粒.因此,超濾既可應(yīng)用于除去液中膠體懸浮微粒,又能分離出溶液中地溶質(zhì).超濾地工作原理是:凡含有兩種或兩種以上溶質(zhì)地溶液,通過(guò)濾膜分離流動(dòng)時(shí),其中分子體積小地溶質(zhì),經(jīng)濾膜流出,而分子體積較大地溶質(zhì) ,不能通過(guò)濾膜而被截留 [14].超濾法以多孔薄膜為分離介質(zhì),依靠薄膜兩側(cè)壓力差作為推力來(lái)分離溶液中不同分子量地物質(zhì),從而起到提純地作用.它具有不需加熱,操作條件溫和,不必添加化學(xué)試劑,不損壞黃酮類化合物,不存在相地轉(zhuǎn)換,耗能低,分離率高,超濾裝置可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn).控制超濾膜孔徑大小能有效除去溶液中大分子物質(zhì) ,選用適宜孔徑地超濾膜是提高產(chǎn)品收率和質(zhì)量地關(guān)鍵 .20 世紀(jì)80 年代后期,采用超濾技術(shù)提取黃芩苷,收到了較好地效果 . 在溶液溫度為 14℃,pH=1.5 時(shí),提取黃酮類化合物地收率較高.S42ehLvE3M5.2.6 酶提取法植物地有效成分往往被包裹在細(xì)胞壁內(nèi) ,提取時(shí)細(xì)胞壁造成傳質(zhì)阻力 ,使提取效果受到很大地限制 .酶地作用可使細(xì)胞壁疏松、破裂 ,因此需要減小傳質(zhì)阻力,加速有效成分地釋放,從而提高提取效率[15].畢會(huì)敏等用纖維素酶法提取紅景天總黃酮,最佳工藝條件為:加酶量1.95%(以原料干重計(jì)>,液料比70∶1(體積質(zhì)量比,mL∶g>,pH紅景天總黃酮地浸出率為 4.385%.解處理 ,可提高黃酮類物質(zhì)地浸出率

值5.5, 酶解溫度40℃,酶解時(shí)間5h,研究表明,采用纖維素酶對(duì)紅景天進(jìn)行酶, 且粗提物產(chǎn)率高 ,DPPH清除活性強(qiáng).501nNvZFis5.2.7 超臨界流體提取法該法(SupercriticalFlu2idsExtraction,SFE> 是20 世紀(jì)80 年代發(fā)展起來(lái)地一項(xiàng)提取分離技術(shù) ,利用超臨界流體 (SupercriticalFluids,SCE> 為萃取劑,從液體或固體中萃取出待測(cè)組分 , 其中超臨界二氧化碳最為常用

(SCF

2CO2>.SFE

具有提取效率高、無(wú)溶劑殘留、天然植物中活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞等優(yōu)點(diǎn)

,同時(shí)還可以通過(guò)控制臨界溫度和壓力地變化

,達(dá)到選擇性提取和分離化合物地目地

.jW1viftGw9黃酮類化合物分離方法地研究進(jìn)展由于黃酮化合物地性質(zhì)不同 ,其分離原理有:極性大小不同,利用吸附能力或分配原理進(jìn)行分離。酸性強(qiáng)弱不同,利用pH梯度萃取進(jìn)行分離。分子大小不同,利用葡聚糖凝膠分子篩進(jìn)行分離。分子中某些特殊結(jié)構(gòu),利用與金屬鹽絡(luò)合能力地不同進(jìn)行分離.6.1pH

梯度萃取pH

梯度萃取適合分離酸性強(qiáng)弱不同地游離黃酮類化合物

.將混合物溶于有機(jī)溶劑(如乙醚>,依次用5%碳酸氫鈉(萃取7,4′2二羥基黃酮>、5%地碳酸鈉(萃取72羥基黃酮或4′2羥基黃酮>、0.2%氫氧化鈉(萃取一般酚羥基黃酮>、4%氫氧化鈉(萃取52羥基黃酮>萃取而使其分離.xS0DOYWHLP6.2 高效液相色譜分析(HPLC>法運(yùn)用HPLC法分離黃酮類化合物地報(bào)道很多.有人對(duì)18種黃酮及黃酮苷類化合物在C8、C18和CN3種固定相上洗脫地RP2HPLC法分離做了研究,結(jié)果表明C18基本可以使植物黃酮苷元和配基實(shí)現(xiàn)分離,但它對(duì)極性大地苷部分洗脫出峰快,分離效果不大理想.而C8介于C18和CN之間,因而對(duì)黃酮苷地分離比較理想,峰形和分離也最好.HPLC也可以用來(lái)測(cè)定黃酮地含量[16].LOZMkIqI0w6.3 高速逆流色譜分離法高速逆流色譜分離法(highspeedcountercur2rentchromatography,HSCCC>是一種新地分離技術(shù).其具有兩大突出特點(diǎn):(1>線圈中固定相不需要載體,因而清除了氣液色譜中由于使用載體而帶來(lái)地吸附現(xiàn)象。(2>特別運(yùn)用于制備性分離,每次進(jìn)樣體積較大,進(jìn)樣量也較多.李彩俠等提取荷葉中黃酮類化合物,經(jīng)HSCCC分離純化地效果很好,結(jié)合TLC分析、顏色反應(yīng)鑒定得到兩種純度很高地黃酮醇類化合物.HSCCC對(duì)分離和制備黃酮類化合物有很大地優(yōu)勢(shì),其應(yīng)用前景越來(lái)越受到人們地關(guān)注.ZKZUQsUJed6.4柱色譜法6.4.1硅膠柱色譜[17]此法應(yīng)用范圍最廣,非極性與極性化合物都能用,適用于分離黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃酮苷元類 .少數(shù)情況下,在加水活化后也可以用于分離極性較大地化合物,如羥基黃酮醇類及其苷類等.與硅膠混存地微量金屬離子,應(yīng)預(yù)先用濃鹽酸處理,以免干擾分離效果.dGY2mcoKtT6.4.2聚酰胺柱色譜分離黃酮類化合物 ,聚酰胺是較為理想地吸附劑 .其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基地?cái)?shù)目、位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力地大小.由己內(nèi)酰胺聚合而成地尼龍-66及由己二酸與己二胺聚合而成地尼龍-66,最早應(yīng)用于黃酮類化合物地分離.此法是目前最有效而簡(jiǎn)便地方法.rCYbSWRLIA6.4.3 葡聚糖凝膠(Sephadexgel>柱色譜黃酮類化合物地分離,主要使用兩種型號(hào)地凝膠:Sepha2dexG型和SephadexLH220型.其原理主要是吸附作用.凝膠對(duì)黃酮類化合物地吸附程度取決于游離羥基地?cái)?shù)目.但分離黃酮苷時(shí) ,分子篩地性質(zhì)起主導(dǎo)作用 .在洗脫時(shí),黃酮苷類大體上是按相對(duì)分子質(zhì)量由大到小地順序流出柱體 .FyXjoFlMWh6.4.3 大孔吸附樹(shù)脂分離法該法是以大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑和分子篩地柱色譜分離形式 .其原理是吸附性和分子篩性.吸附性主要來(lái)源于范德華力和氫鍵作用力。分子篩性來(lái)源于大孔樹(shù)脂地多孔性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生地滲透和過(guò)濾作用 .被分離地成分根據(jù)其分子地大小不同和吸附能力地差異而分離

.近年來(lái)大孔吸附樹(shù)脂在中藥成分

(如黃酮、生物堿等

>精制純化等領(lǐng)域中應(yīng)用越來(lái)越廣泛

[18].劉健偉等對(duì)

D101

型(非極性>

、Hz2806型(中等極性>和AB28型(弱極性>3種大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了篩選 ,并對(duì)甘草中總黃酮分離純化工藝進(jìn)行了研究。王雅君等則用 D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行了制備菟絲子總黃酮地研究.這些研究表明,大孔吸附樹(shù)脂對(duì)于黃酮類化合物具有良好地分離純化效果 ,與傳統(tǒng)地分離方法相比 ,具有操作簡(jiǎn)便、樹(shù)脂再生容易、耗費(fèi)有機(jī)溶劑少、提取率高等優(yōu)點(diǎn) .TuWrUpPObX結(jié)論及展望由于黃酮類化合物具有降壓、降血脂、抗骨質(zhì)舒松、抗心律失常等多種藥理和保健作用,特別是具有抗自由基及抗癌、防癌地作用,使其在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域地應(yīng)用具有廣闊地前景.大部分毒理學(xué)研究提示黃酮類化合物一般無(wú)毒,由于黃酮類化合物可能存在幾種不同地作用機(jī)制與合成途徑 ,研究者們對(duì)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果地解釋可能仍然存在不足之處 .基于此還需要考慮其活性成分地穩(wěn)定性以及加工和貯藏過(guò)程中活性成分與藥物中其它成分地交互作用 .今后黃酮類化合物地研究還需要關(guān)注地是生物利用度、代謝動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)地氧化損傷以及長(zhǎng)期服用產(chǎn)生地慢性后果等方面[19,20].開(kāi)發(fā)出可靠地,令人信服地模型或系統(tǒng)以精確評(píng)估黃酮類化合物在人體內(nèi)地代謝作用也是十分必要地 .7qWAq9jPqE參考文獻(xiàn)

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