NK-T細(xì)胞淋巴瘤的體外化療敏感試驗(yàn)及臨床意義張喜愛，周超鋒，張明智（450052鄭州，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科）[摘要]目的以人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以細(xì)胞抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）為指標(biāo)，研究NK/T細(xì)胞淋巴瘤對(duì)8種臨床常用化療藥物體外敏感狀況，評(píng)價(jià)其對(duì)臨床化療藥物選擇的指導(dǎo)意義。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。結(jié)果SNK-6對(duì)不同抗癌藥物的敏感性存在較大的差異，依[通訊作者]張明智，E-mail:mingzhi_zhang@126.comIC50值大小，其藥敏程度由高到低依次是長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、門冬酰胺酶、順鉑、阿霉素、卡鉑，單藥兩組間比較，差異有顯著性（P＜0.05），甲氨蝶呤無(wú)明顯劑量依賴性，異環(huán)磷酰胺體外無(wú)抗腫瘤活性。結(jié)論在細(xì)胞抑制率的基礎(chǔ)上優(yōu)選出對(duì)SNK-6相對(duì)敏感的抗癌藥物，為NK/T淋巴瘤的化療方案制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。[通訊作者]張明智，E-mail:mingzhi_zhang@126.com[關(guān)鍵詞]NK-T細(xì)胞淋巴瘤；體外藥敏試驗(yàn)MTT；半數(shù)抑制濃度IC50[中圖法分類號(hào)]SensitivityexperimentofchemotherapeuticDrugsforNK-Tcelllymphomainvitroandit’sClinicalsignificanceZhangXiai，ZhangMingzhi（DepartmentofOncology,FirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,HenanProvince,450052,China）[Abstract]ObjectiveThestudywastoinvestigatethechemosensitivityofNK/T-celllymphomacelllineSNK-6toantitumordrugsusinginvitroMTTassaychemosensitivitytest,andevaluateitsclinicalsignificanceofchemotherapydrugselection.MethodsThesensitivityofSNK-6cellstoeightcytotoxicdrugswastestedusinginvitroMTTassay,andcalculatedtheIC50.ResultsThesensitivityofSNK-6cellstocytotoxicdrugsvariedgreatlybetweendifferentantitumordrugs.Thesensitivitysequenceofchemotherapeuticdrugsfromhightolowasfllows:vincristine、etoposide、L-asparagine、cisplatin、doxorubicine、carboplatin，thereweresignificantdifferencesinsensitivityamongthesingledruggroups,(P<0.05).Methotrexatewasdose-independent,ifosfamidewasnoantitumoractivityinvitro.ConclusionOnthebasisofcellinhibitionrateofSNK-6,wecanselectsomerelativelysensitiveanti-cancerdrugsforNK/Tlymphoma,anditshascertainclinicalguidingsignificance.[Keywords]NK/TCelllymphoma;MTTchemosensitivitytest;IC50NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NK/Tcelllymphoma)主要發(fā)生于結(jié)外,占全部惡性淋巴瘤的2%～10%。該病是一種從發(fā)病機(jī)制到診斷、分型都很復(fù)雜的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)是最常見的致中線面部進(jìn)行性破壞的疾患之一。因其起病隱匿、早期診斷困難，加上具有高度侵襲性,病程進(jìn)展快,生存期短，預(yù)后較差等特點(diǎn)，已對(duì)人類的健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅?；熓荖K-T細(xì)胞淋巴瘤晚期病例必不可少的治療手段,但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的固有的或獲得性的耐藥則是影響NK-T淋巴瘤難以取得確切療效的主要障礙淋巴瘤化療效果的主要障礙，臨床治療效果差。近年來(lái)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法（MTT）法已被廣泛用于各種腫瘤體外藥敏譜的研究[1]，特別是實(shí)體腫瘤方面,體外藥敏測(cè)定結(jié)果與臨床總符合率達(dá)到74%～90%[2]，但是在淋巴瘤方面，特別是NK-T淋巴瘤，此類研究尚不多見。我們實(shí)驗(yàn)采用NK-T淋巴瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和MTT法對(duì)SNK-6進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)SNK-6是市售細(xì)胞株，怎么是SNK-6是市售細(xì)胞株，怎么是原代細(xì)胞培養(yǎng)？1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)胞來(lái)源來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室。1.1.2試劑培養(yǎng)基為PRMI一1640培養(yǎng)基（Gibco公司），內(nèi)含10%人AB型血清（鄭大一附院血庫(kù)）。四甲基氮哩藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司)，配制成5mg/ml工作液，過濾除菌，4℃保存。二甲基亞諷(DMSO，美國(guó)S1.1.3儀器CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰儀器廠生產(chǎn))、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Red制造)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。1.1.4抗腫瘤藥物及配置順鉑(DDP，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字20043889)、卡鉑(CBP，山東齊魯制藥廠H20020181)、門冬酰胺酶（L-Asp，江蘇常州千紅生化制藥股份有限公司H19993107）、阿霉素(ADM，浙江海正藥業(yè)有限公司H33021980)、依托泊苷（VP-16，齊魯制藥有限公司0010012EV）、長(zhǎng)春新堿（VCR，浙江海正藥業(yè)有限公司H20043326）、甲氨蝶呤（MTX，依比威藥品有限公司H20030447）、異環(huán)磷酰胺（IFO，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司H10950291）阿霉素、卡鉑用5%葡萄糖溶液，其余各藥用生理鹽水配制到所需濃度，一20℃貯存置冰箱中待用。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察將SNK-6細(xì)胞培養(yǎng)于含10﹪人AB型血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于CO2濃度為5%,相對(duì)濕度為95%,溫度為37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),1.2.2MTT比色法測(cè)定藥物的抗癌活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNK-6細(xì)胞用含10%人血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成3×105/ml的單細(xì)胞懸液接種至96孔板中,每孔180μl,每組設(shè)4個(gè)平行孔,然后分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物,終體積為200μl。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后,每孔加入MTT溶液(5mg/L)20μl,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心(3000rpm)10min,快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150μlDMSO,室溫下在微量振蕩器上震蕩10min使結(jié)晶充分溶解,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490μm波長(zhǎng)處的吸光度以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次,求平均值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-試驗(yàn)孔OD值/腫瘤細(xì)胞空白對(duì)照OD值)×100%IC50為抑制細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)以50%時(shí)藥物濃度,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理可得。1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用方差分析比較組間均數(shù)差異，以雙側(cè)p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1SNK-6細(xì)胞形態(tài)熒光倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為大小不一，形態(tài)不一，懸浮抱團(tuán)生長(zhǎng)。（見圖1）。本文以MTT法檢測(cè)NK-T細(xì)胞淋巴瘤的體外化療敏感性，指標(biāo)單一，主要化療方案藥物未能大部包括，尤其是用細(xì)胞株檢測(cè)，臨床意義有限。如稿源豐富，可做退稿處理；也可修改后作經(jīng)驗(yàn)交流刊用。圖1：熒光顯微鏡下的SNK-6細(xì)胞形態(tài)（×100）2.2不同濃度化療藥物對(duì)SNK-6細(xì)胞處理48h的增殖抑制作用常規(guī)培養(yǎng)的SNK-6細(xì)胞系細(xì)胞抑制率為0。在一定濃度范圍內(nèi),不同藥物對(duì)NK/T淋巴瘤細(xì)胞的抑制率,隨濃度的增加而增加,并存在濃度依賴性;在相同摩爾濃度下,抑制率從大到小的順序依次為:長(zhǎng)春新堿、依托泊苷、門冬酰胺酶、順鉑、阿霉素，此時(shí)各種藥物對(duì)SNK-6的IC50值分別為0.255u希文（下同）！g/ml、2.61ug/ml、3.28ug/ml、3.47ug/ml、6.82ug/ml（見表1）。卡鉑對(duì)SNK-6細(xì)胞系的抑制作用不明顯，IC50值為80.93ug/ml，在相同劑量梯度下，依托泊苷、順鉑、卡鉑三組單藥兩兩組間比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甲氨蝶呤對(duì)SNK-6細(xì)胞系的抑制作用無(wú)明顯劑量依賴性，異環(huán)磷酰胺在體外無(wú)抗腫瘤活性。希文（下同）！表1.不同藥物對(duì)NK/T細(xì)胞淋巴瘤的抑制率（x±s）Table1.InhibitionofdifferentdrugsonSNK-6cell長(zhǎng)春新堿依托泊苷a門冬酰胺酶順鉑b阿霉素卡鉑c劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)劑量梯度(ug/mL)抑制率(%)883.30+3.6716090.33+0.5810074.71+2.5616092.34+2.313277.85+1.8216058.33+1.520.874.50+2.084079.30+2.161067.75+2.064078.60+2.07857.63+1.714040.00+1.420.0851.67+1.531068.30+2.31147.14+2.341068.00+1.58228.50+2.071026.30+1.520.00826.33+1.532.556.40+1.530.110.86+1.352.549.25+2.500.513.83+2.312.510.75+1.700.000816.50+2.120.6323.00+2.010.01——0.6325.50+3.410.137.13+1.730.633.25+1.05*a與c比較＜0.05；b與c比較P＜0.05。3討論NK/T淋巴瘤嚴(yán)重威脅人們的身心健康，綜合治療是目前治療NK/T腫瘤的常用手段，但療效不盡如人意，比如化療藥物毒副作用較大、治愈率低。本病具有侵襲性、原發(fā)或繼發(fā)耐藥往往導(dǎo)致治療失敗。因此，從不同的途徑尋找高效低毒的抗腫瘤藥仍是當(dāng)務(wù)之急。MTT比色分析法根據(jù)活細(xì)胞的線粒體中脫氫酶系將四唑藍(lán)還原成不溶性藍(lán)紫色沉淀物甲zan找中文漢字的原理,測(cè)定藥物作用下的活細(xì)胞數(shù)量.Sargent等[3]經(jīng)過多年對(duì)此法的研究應(yīng)用,認(rèn)為MTT法結(jié)果與化療敏感和耐藥有顯著的一致性,能為臨床選擇化療方案提供相對(duì)準(zhǔn)確的依據(jù)。找中文漢字以往臨床上NK/T細(xì)胞淋巴瘤應(yīng)用最廣泛的治療方法是以CHOP類含蒽環(huán)類藥物的方案，但約60%的患者治療失敗，其治療失敗的機(jī)制尚不明確。近年的研究認(rèn)為NK/T細(xì)胞淋巴瘤的化療耐藥與P-gp/mdr1基因的高表達(dá)有關(guān)[4]。因此,應(yīng)當(dāng)選擇不受P-gp/mdr1的影響的藥物[5.6]。Kitoh[7]研究左旋門冬酰胺酶治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用可能不受P-gp/mdr1的影響。而且近年報(bào)道應(yīng)用以左旋門冬酰胺酶為主的化療方案治療CHOP類方案耐藥的NK/T細(xì)胞淋巴瘤取得了明顯療效[8.9]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，門冬酰胺酶對(duì)NK/T淋巴瘤的抑制率高于阿霉素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述結(jié)論是一致的。另外根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，卡鉑、異環(huán)磷酰胺也是不依賴于多藥耐藥基因（P-gp）的藥物[10]，但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是卡鉑對(duì)SNK-6抑制作用不明顯，與此并不一致，可能由于體外培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞并不能完全代表體內(nèi)腫瘤的惡性細(xì)胞，對(duì)藥物的敏感度與體內(nèi)不完全一致。異環(huán)磷酰胺體外無(wú)明顯抗腫瘤活性，只有在進(jìn)入體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的磷酰胺酶或磷酸水解酶水解，變?yōu)榛罨饔眯偷牧柞０返娌虐l(fā)揮其抗腫瘤作用,我們的實(shí)驗(yàn)中當(dāng)異環(huán)磷酰胺劑量達(dá)到1mg時(shí)，對(duì)SNK-6的抑制率僅接近50%。順鉑與卡鉑作用機(jī)制相同，都是通過抑制DNA合成，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，順鉑對(duì)NK/T細(xì)胞淋巴瘤的抑制作用較卡鉑強(qiáng)，但需要指出的是，順鉑的毒副作用也明顯大于卡鉑，臨床用藥應(yīng)考慮到這一點(diǎn)。目前臨床上已用于治療NK/T淋巴瘤的化療方案如DeVIC（地塞米松、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、卡鉑）、MPVIC-P（依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、卡鉑、甲氨蝶呤、潑尼松龍）、SMILE（地塞米松、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、門冬酰胺酶、依托泊苷），在治療進(jìn)展性難治或復(fù)發(fā)的鼻型NK/T淋巴瘤方面，都取得了既安全又有前景的結(jié)果[11]，這幾種方案中幾乎都含有依托泊苷、卡鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺。依托泊苷是治療NK/T細(xì)胞淋巴瘤最主要并發(fā)癥——嗜血細(xì)胞綜合癥（VAHS）的有效藥物[10]，在體外實(shí)驗(yàn)中，依托泊苷在2.5ug/ml時(shí)對(duì)SNK-6的抑制率已達(dá)到56.4%，也正說(shuō)明了這一點(diǎn)。Hongo等[12]研究得出MTX、PDN、DEX為非劑量依賴性，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)，但是甲氨蝶呤對(duì)SNK-6的抑制率并不低，大致在50%左右，所以臨床上用甲氨蝶呤治療NK/T淋巴瘤也是值得肯定的。長(zhǎng)春新堿為治療惡性淋巴瘤的常用藥物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)NK/T淋巴瘤也有較強(qiáng)的抑制作用，提示可以嘗試應(yīng)用于治療NK/T淋巴瘤。綜上所述，我們腫瘤體外藥敏試驗(yàn)所得結(jié)果與以往研究及臨床主要治療藥物是基本吻合的，因此可以作為NK/T淋巴瘤的化療方案制定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使其在藥敏測(cè)定結(jié)果的指導(dǎo)下進(jìn)行化療，最大限度地發(fā)揮化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)避免不必要的藥物毒性及耐藥產(chǎn)生，對(duì)于提高NK/T細(xì)胞淋巴瘤化療效果具有一定的臨床指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)：[1]BurtonJD.TheMTTassaytoevaluatechemosensitivity[J].MethodsMolMed,2005,110(1):69-78[2]張銀霞,于蘭,呂同德.腫瘤藥敏試驗(yàn)方法及臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2003,9(1):34～35.[3]SergeantJM.TheuseoftheMTTassaytostudydrugresistanceinfreshtumorsamples[J].RecentResultsCancerRes,2003,161(1):13-25[4]勇威本.鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤的診斷與治療進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展,2005,3(1):41-43.[5]YamaguchiM,OguchiM,TobinaiKetal.PhaseI/IIstudyofconcurrentchemoradiotherapyfornewly-diagnosed,localizednasalNK/T-celllymphoma:resultsofaphaseIportionofJCOG0211-DI.Blood2005;106:2685.[6]LeeKW,YunT,KimDWetal.First-lineifosfamide,methotrexate,etoposideandprednisolonechemotherapy+/-radiotherapyisactiveinstageI/IIextranodalNK/T-celllymphoma.LeukLymphoma2006;47:1274–1282.[7]KitohT,SuzukiT,NagafujiK,etal.IdentificationofL-asparaginasesensitivitynasalnaturalkiller/naturalkiller–likeT-celllymphoma:Usefulnessofmmunostainingresultforasparaginesynthetaseinlymphomacells.Ketsueki-Schuyou-Ka,2003,46∶108[8]WeibenY,WenZ,JunZ,etal.MidlineNK/T-celllymphomanasal-tape:treatmentoutcome,theeffectofL–asparaginasebasedregimen,andprognoeticfactors[J].HematolOncol,2006,24:28-32[9]JaccardA,PetitB,GiraultS,etal.L-Asparaginase-base