第三章食品微生物檢驗的常用試劑及配制1整理課件了解染色的基本原理。掌握常用染料的性質及其染色的配制技術。熟悉常用試劑、緩沖溶液、物質的量濃度的配制技術。了解培養(yǎng)基的種類及一些常見培養(yǎng)基的用途，掌握一般培養(yǎng)基的配制技術。2整理課件第一節(jié)染料及染液配制技術一、染色原理微生物染色的基本原理，是借助物理和化學因素的作用而進行的。物理因素：細胞及細胞物質對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W因素：正負離子之間的相互吸引等。

3整理課件二、染料的種類

染料按其電離后所帶電荷的性質可分為以下類型：

1.酸性染料：如酸性復紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸等。

2.堿性染料：一般有堿性復紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結晶紫、美蘭、甲基紫等，細菌易被堿性染料染色。

3.中性（復合）染料：如伊紅美蘭等，瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等（常用于細胞核染色）。

4.單純染色：這類染料的化學親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudanb)的染料

4整理課件染色細菌標本檢查法

－－染料細菌染色用的染料酸性染料（陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與帶陽電的物質結合，使之著色。降低菌液的pH而使細菌帶陽電時，就可用酸性染料染色。（伊紅、剛果紅）堿性染料（陽離子染料）：與帶負電的物質結合，細菌一般帶負電，所以細菌染色所用的染料，常用堿性染料（堿性復紅、美藍）。復合染料：堿性染料與酸性染料的結合物（伊紅美藍、伊紅天青）。單純染料：不能與被染物生成鹽類5整理課件

堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋電質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等)使其著色。

酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH值下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。

中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料．如伊紅美藍、伊紅天青等。

6整理課件7整理課件三、常用染液的配制1.常用染料的溶解度表3-12.常用染料的配制

8整理課件第二節(jié)常用試劑的配制技術一、緩沖液的配制技術9整理課件二、物質的量濃度溶液的配制技術1.溶液濃度表示法2.物質的量濃度溶液的配制方法3.溶液濃度的調整4.常用酸堿的物質的量濃度計算10整理課件三、pH指示劑的配制技術11整理課件四、血清學反應試劑制備技術血清學實驗在第五章講解12整理課件五、生化試劑制備技術及試驗法什么是微生物生化試驗?指通過利用生物化學的方法來測定微生物的代謝產物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。

由于細菌各自酶系統(tǒng)不同，新陳代謝的產物也有所不同，而這些產物又各具有不同的生物化學特性。為此，可利用生物化學的方法來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的細菌。13整理課件細菌的生化反應檢查法1.在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的pH值變化。2.在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產物所生成的顏色反應。3.根據(jù)酶作用的反應特性，測定酶的存在。4.根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。14整理課件生化試驗的注意事項1.待檢菌應是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。2.待檢菌應是純種培養(yǎng)物。3.遵守觀察反應的時間。觀察結果的時間，多為24或48小時。4.應做必要的對照試驗。5.提高陽性檢出率，至少挑取2-3個待檢的疑似菌落分別進行試驗。15整理課件生化試驗分類（一）糖（醇）類代謝試驗

（二）氨基酸和蛋白質代謝試驗（三）有機酸鹽和銨鹽代謝試驗（四）酶類試驗16整理課件（一）糖（醇）類代謝試驗

1.糖醇類發(fā)酵試驗

2.V-P試驗

3.甲基紅（MethylRed）試驗MR17整理課件

1.糖醇類發(fā)酵試驗

原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產生的代謝產物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1~2種糖醇，有的分解糖醇能產酸產氣，有的分解糖醇只產酸不產氣，根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。18整理課件糖發(fā)酵試驗原理

不同微生物發(fā)酵糖的能力各異，產生的分解產物也不同，可以作為細菌分類鑒定的手段。大腸埃希菌/產氣腸桿菌葡萄糖CH3COCOOHHCOOH甲酸解氫酶H2+CO2傷寒沙門菌葡萄糖CH3COCOOHHCOOH指示劑：溴麝香草酚藍pH<6.3(黃)；6.3<pH<7.2(綠)；pH>7.2(藍)pH6.3pH7.2舉例19整理課件常用的糖醇單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇20整理課件2）試驗方法

(1)試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有酚紅、溴麝香草酚藍

顏色反應較敏感，但穩(wěn)定性較差。溴甲酚紫和酸性復紅

比較穩(wěn)定，特別是對發(fā)酵遲緩的細菌，培養(yǎng)時間較長，宜選則二者。

(2)培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管，半固體糖發(fā)酵管，固體糖發(fā)酵管，雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管。

21整理課件2）試驗操作方法

以無菌操作的方法將經分離培養(yǎng)的純種細菌用接種針或環(huán)移取，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置36±1.0℃

置溫箱內培養(yǎng)經一定時間(數(shù)小時至二周)培養(yǎng)，然后每天觀察結果。

22整理課件1.糖發(fā)酵試驗要注意杜氏小管的置入方法；2.在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。注意事項23整理課件杜氏小管灌裝

灌裝不好會使杜氏小管中有氣泡，影響觀察結果。首先將試管中裝滿培養(yǎng)液，然后用醫(yī)用注射器吸取一定量培養(yǎng)液，排空其中空氣，將針頭伸到杜氏小管底部(防止氣泡產生)，緩緩將培養(yǎng)液推入杜氏小管直到凸起(表面張力作用)，再至過量以至培養(yǎng)液潤濕杜氏小管外表，因培養(yǎng)液具有一定粘滯力，它可使?jié)駶櫟亩攀闲」苜N著試管放入時慢慢滑到試管底部，而不撞破試管底部。

24整理課件氣泡導管氣泡陽性陽性陰性培養(yǎng)基變?yōu)辄S色培養(yǎng)基未變色、無氣泡產生結果記錄：

產酸不產氣，陽性，以“+”表示產酸產氣，陽性，以“⊕”表示不產酸產氣，陰性，以“-”表示25整理課件

2.V-P試驗（乙酰甲基甲醇試驗）

1）原理：某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。26整理課件V.P.試驗(伏―普試驗)

用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力。27整理課件某些細菌在糖代謝過程中，經糖酵解途徑產生丙酮酸。因不同細菌所含酶不同，進一步對丙酮酸的代謝也不同。大腸埃希菌產氣腸桿菌2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3+2CO2O2+KOHCH3COCHOHCH3CH3COCOCH3CH3COCOCH3+胍基紅色化合物+H2OVP試驗陰性。VP試驗（V）實驗原理

舉例28整理課件應用：主要用于大腸埃希菌和產氣腸桿菌的鑒別。本試驗常與MR試驗一起使用，一般情況下，前者為陽性的細菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細菌不一定都這樣規(guī)律。29整理課件2）V.P.試驗

取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1號接種大腸桿菌，2號接產氣桿菌，第3支接未知菌。

37℃培養(yǎng)48h后，加入40%KOH5~10滴，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃溫箱中保溫30min，以加快反應速度。觀察培養(yǎng)基的顏色變化。

3）結果觀察與記錄

（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P+

（2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P-30整理課件注意事項VP實驗一定要注意開蓋振蕩！且反應時間較長。31整理課件中文名稱：大腸埃希菌菌株保藏編號：CVCC3038特征特性：

非抗酸性

化能異養(yǎng)最適溫度37.pH7.2~7.4

不利用檸檬酸鹽可發(fā)酵多種碳水化合物如：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇接觸酶陽性、氧化酶陰性、脲酶陰性.MR試驗陽性、VP試驗陰性

屬名：Escherichia種名加詞：coli32整理課件

3.甲基紅（MR）試驗

1）原理：腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。33整理課件檢測不同細菌分解葡萄糖產酸的能力。大腸埃希菌葡萄糖產氣腸桿菌指示劑：甲酸乙酸乳酸琥珀酸等分解甲酸、乙醇和乙酰甲基甲醇

pH>5.4葡萄糖分解甲基紅pH<4.5(紅)；pH>5.4(橘黃色)。甲基紅試驗實驗原理pH4.5pH5.4舉例34整理課件2）試驗方法：

挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)3~5天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1ml，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結果。

35整理課件3）結果觀察與記錄（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；（2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結果。36整理課件MR-VP試驗原理及照片V-P37整理課件1.靛基質（吲哚）試驗2.H2S試驗3.尿素酶試驗

（二）氨基酸和蛋白質代謝試驗38整理課件1.吲哚試驗

（靛基質試驗）

1）原理：某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。39整理課件吲哚試驗色氨酸分解反應：吲哚反應：40整理課件

不同微生物所含酶系統(tǒng)不同，某些細菌含有色氨酸酶，能夠分解培養(yǎng)基內蛋白胨中的色氨酸。大腸埃希菌色氨酸產氣腸桿菌色氨酸酶+H2OCH3COCOOH吲哚+檢測：吲哚+對二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚+H2O玫瑰紅色吲哚試驗陽性+吲哚試驗實驗原理吲哚陰性-舉例41整理課件2）試驗方法：

取3支胰蛋白水培養(yǎng)基培養(yǎng)基，1號接種大腸桿菌，2號接種產氣桿菌，第3支接未知菌。

37℃培養(yǎng)24h～48h。

沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結果。3）結果觀察與記錄

呈現(xiàn)玫瑰紅色,為陽性反應,記+

無紅色者,為陰性反應,記-42整理課件靛基質試驗原理及照片靛基質+43整理課件2.硫化氫產生試驗1）原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細菌。

44整理課件

2）方法與結果

(1)瓊脂穿刺法：培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基。 操作：將試驗細菌以接種針沿管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經37℃24-48h培養(yǎng)后，觀察結果。 結果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當產生硫化氫量少時，為了便于觀察結果，在穿刺接種培養(yǎng)時，一定要沿培養(yǎng)基管壁進行。

(2)醋酸鉛試紙法：培養(yǎng)基：含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基、浸有醋酸鉛的濾紙條。操作：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，37℃培養(yǎng)24-48h。結果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。45整理課件3）結果觀察與記錄培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-

46整理課件3.尿素分解試驗尿素酶（Urease）試驗1）原理：有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解、產生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈粉紅色。培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。1）未接種2）尿素酶陽性3）尿素酶陰性47整理課件2）試驗方法：

挑取大量培養(yǎng)18~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。48整理課件尿素酶試驗圖陽性3）結果觀察與記錄培養(yǎng)基呈粉紅色，為陽性，記+培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記-49整理課件（三）呼吸酶類試驗氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗氰化鉀試驗50整理課件1.氧化酶試驗1）原理:

氧化酶使細胞色素C氧化后，氧化型細胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物,再和α-萘酚結合,生成吲哚酚藍,呈藍色反應，為陽性。51整理課件氧化酶或稱細胞色素氧化酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗時，此酶首先使細胞色素C氧化，然后氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。本實驗腸桿菌科陰性，弧菌科，非發(fā)酵菌陽性（個別除外），奈瑟菌屬均陽性。試驗方法取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；再加α-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內呈現(xiàn)鮮藍色。陰性于兩分鐘內不變色。

52整理課件用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細菌的區(qū)別，前者陽性，而后者陰性。莫拉菌屬、產堿桿菌屬等均為陽性。異常結果：奈瑟菌屬有腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等9種致病菌，引起流行性腦脊髓膜炎上呼吸道癥狀：鼻咽炎等全身感染癥狀：高熱、出血點或瘀血點，腦膜炎癥狀：頭痛、嘔吐、頸項強直;引起淋病，引起新生兒淋病性眼結膜炎。53整理課件氧化酶試驗注意事項：①試驗時應避免接觸含鐵物質，以免出現(xiàn)假陽性。②10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應經常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍色，應棄去不用。54整理課件試劑1%鹽酸二甲基對苯二胺1%α-萘酚-乙醇液55整理課件藍色為+不變色或為粉紅色為-56整理課件2.過氧化氫酶試驗1）原理：某些細菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產生氣泡，即為陽性反應。57整理課件2）試驗方法

用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1-2滴在培養(yǎng)物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1-2滴,在30秒內判定試驗結果。3）結果觀察與記錄

在30秒內呈藍色反應,為陽性,記+

不變色或為粉紅色者,為陰性,記-58整理課件2）試驗方法

取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結果。59整理課件3）結果觀察與記錄產生氣泡者，為陽性，記+不產生氣泡者，為陰性，記-60整理課件3.硝酸鹽還原試驗1）原理：某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應，為陽性反應。61整理課件試劑A、對氨基苯磺酸試劑B、α-萘胺試劑62整理課件2）試驗方法

取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結果。63整理課件3）結果觀察與記錄呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記-64整理課件4.氰化鉀試驗1）原理：

氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌.65整理課件2）試驗方法

取培養(yǎng)20～24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內，立即以橡膠塞塞緊，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結果。66整理課件3）結果觀察與記錄對照管有菌生長，試驗管有菌生長為陽性，記+。對照管有菌生長，試驗管無菌生長為陰性。記-。67整理課件

（四）毒性酶類試驗溶血試驗血漿凝固酶試驗68整理課件1.溶血試驗1）原理：

某些細菌在代謝過程中能產生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應，借此可鑒別細菌。69整理課件2）試驗方法平板法試管法70整理課件平板法將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)24～48h，觀察結果。71整理課件溶血試驗的溶血類型及現(xiàn)象（1）α（甲型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。（2）β（乙型）溶血:菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。（3）γ（丙型）溶血:菌落周圍無溶血環(huán)。72整理課件甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血73整理課件β（乙型）溶血74整理課件試管法

將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在36±1℃培養(yǎng)16～18h，觀察結果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。75整理課件3）結果觀察與記錄有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+；無溶血現(xiàn)象，為陰性，記-76整理課件2.血漿凝固酶試驗1）原理：致病性葡萄球菌能產生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，附著在細菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。77整理課件2）試驗方法（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min內,如血漿內出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。78整理課件有凝塊均勻混濁血漿生理鹽水血漿凝固酶試驗79整理課件（2）試管法

取滅菌小試管3支，各加入血漿－無菌水(1:1)0.5ml，1支加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（或濃菌懸液）0.5ml；其余2支作對照管，1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對照;另1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9％氯化鈉溶0.5ml作空白對照。將3管同時放37℃溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，4h內無凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時。80整理課件陽性反應陰性反應不凝固少量、零散凝固明顯的塊狀凝固巨大塊凝固完全凝固，倒置不流動81整理課件金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗

82整理課件3）試管法的結果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固。試驗管血漿凝固者為陽性；均無凝固則為陰性。83整理課件其他

檸檬酸鹽利用試驗

1.有機酸鹽的利用試驗84整理課件

枸櫞酸鹽利用試驗

1）原理：

某些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍由淡綠轉為深藍色，為陽性。85整理課件腸桿菌科各種細菌利用檸檬酸鹽的能力不同，有的菌可利用檸檬酸鈉作為碳源，有的則不能。大腸埃希菌產氣腸桿菌

大腸埃希菌不能利用檸檬酸鹽，故不能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。檸檬酸鹽利用試驗陰性。

產氣腸桿菌能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽產生CO2，再生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑BTB由綠色變?yōu)樗{色。枸櫞酸鹽利用試驗（C）實驗原理舉例

86整理課件2）試驗方法

挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在36±1℃培養(yǎng)1~4天，每天觀察結果。87整理課件3）結果觀察與記錄斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{色或深藍色，為陽性，記+；無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色者，為陰性，記-88整理課件檸檬酸鹽試驗原理及斜面照片陽性+89整理課件

2.三糖鐵（TSI）試驗90整理課件1）三糖鐵試驗的原理

如果細菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產酸或產酸產氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質，生成堿性產物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細菌又能分解含硫化合物，產生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。91整理課件制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產生H2S斜面紅色，底部黃色，產生H2S底面黃色，并產生CO292整理課件2）試驗方法以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結果。93整理課件

已知大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌原理？

2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌94整理課件下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌95整理課件思考題提問：志賀氏菌都能分解葡萄糖，產酸不產氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產生H2S。在培養(yǎng)基上應該產生什么現(xiàn)象？大腸桿菌，能分解葡萄糖產酸產氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產生H2S。在培養(yǎng)基上應該是什么現(xiàn)象？沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產生H2S，多數(shù)產氣，在培養(yǎng)基上應該是什么現(xiàn)象？96整理課件第三節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的混合養(yǎng)料。要求：應具備6大營養(yǎng)要素；物質比例合適；必須滅菌。

營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水

97整理課件微生物的六大營養(yǎng)素98整理課件一、培養(yǎng)基的成分與分類

99整理課件營養(yǎng)物質水碳源兼能源氮源無機鹽生長因子細胞的組成成分提供細胞代謝的介質直接參與代謝過程降低細胞內溫度維持生物大分子的天然構象合成含氮物質提供能量構成細胞物質提供能量

構成細胞的組成成分；作為酶的組成成分；維持酶的活性；調節(jié)細胞滲透壓；作為某些自養(yǎng)菌的能源。

1.培養(yǎng)基的成分維持細菌的代謝、繁殖100整理課件2.培養(yǎng)基的分類

⑴按成分的不同分天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基⑵按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基⑶按培養(yǎng)基用途基礎培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基101整理課件二、培養(yǎng)基pH的測定與調整

測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃。調節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。

一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適。

102整理課件二、培養(yǎng)基pH的測定與調整

測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標準溫度為25士2℃。調節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。

當調節(jié)緩沖液的pH時，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。

一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比最終pH調高0.2左右，滅菌后基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定，并記下每次pH的測定結果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導滅菌前pH的調節(jié)。

測定時，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用酸度計校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。103整理課件三、常用培養(yǎng)基的制備技術1.玻璃器皿的清洗制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內，于121℃高壓蒸汽滅菌3min后烘干，備用。（2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端

，然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。

還可以160℃干熱滅菌2h后，備用。104整理課件105整理課件2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項（1）培養(yǎng)基配方的選定（2）培養(yǎng)基的制備記錄（3）培養(yǎng)基成分的稱?。?）培養(yǎng)基各成份的混合和溶化（5）培養(yǎng)基pH的初步調正（6）培養(yǎng)基的過濾澄清（7）培養(yǎng)基的分裝（8）培養(yǎng)基的滅菌（9）培養(yǎng)基的質量測試（10）培養(yǎng)基的保存106整理課件培養(yǎng)基的分裝107整理課件2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項（1）培養(yǎng)基配方的選定同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規(guī)定進行配制外，一般均應盡量收集有關資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。（2）培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，復制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。（3）培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側，每稱完一種成分即在配方做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側，每種稱取完畢后，即移放于右側。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。108整理課件4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補足。5、培養(yǎng)基pH的初步調正因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質量。PH調整后，還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。6、培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。109整理課件7、培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。8、培養(yǎng)基的滅菌一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。9、培養(yǎng)基的質量測試每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。用有關的標準菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。10、培養(yǎng)基的保存培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽110整理課件（4）培養(yǎng)基各成分的混合和熔化溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷齊內。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應經常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分。在使用干燥培養(yǎng)基時，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞。111整理課件大微DW-9型微生物試劑分液器是一款精密輸送液體的電子蠕動泵分液系統(tǒng)，是大微科技專為微生物實驗室中各種試劑溶液(培養(yǎng)基、緩沖液、稀釋液等)的精確計量和分裝而設計，它可以使您頻繁的重復分液操作變得輕松、高效！配備不同直徑的分液管，在得到多種分裝量范圍的同時，保證精確的分液精度。儀器一機多用，1臺設備，即可實現(xiàn)“傾注平板制備”和“試管分裝”等多種用途；被廣泛應用于各種食品、藥品企業(yè)、政府檢測機構和科研單位的專業(yè)微生物實驗室。3.可簡易編程，能夠在設定的時間內分注預設容量的液體，同時顯示分注累積容量。4.分裝快速，1L溶液分裝到100個試管中，最快僅需2分鐘。112整理課件（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時使用的自動分配器須經校準和確認。每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管。固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。平皿：傾注平皿，應在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱中倒置30—60min。讓水蒸汽自然蒸發(fā)。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應用布抹去，以避免污染。高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用。分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當天（2h內最佳）進行滅菌處理。液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時，應延長至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質如尿素、腹水等，可用細菌過濾器，過濾除菌。高壓滅菌應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時間，達到全部殺滅微生物。以上的滅菌時間和溫度要經過驗證確認，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。113整理課件

稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。調pH值：用1NNaOH或1NHCl調pH，用pH試紙對照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當補水。分裝：注意不要污染棉塞。包扎成捆，掛上標簽（必須用鉛筆寫），注明何種培養(yǎng)基。滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。2.培養(yǎng)基的制備114整理課件3.食品檢驗常用培養(yǎng)基的制備技術115整理課件（1）基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g自來水1000mLpH7.2~7.4滅菌

121℃15min用于分離和培養(yǎng)細菌116整理課件

馬鈴薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基（用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基）其配方如下：

去皮馬鈴薯（或鮮豆芽）200g蔗糖（或葡萄糖）20g自來水1000mL瓊脂20gpH自然滅菌：

（含蔗糖）

1.05kg/cm2

20min（含葡萄糖）0.1kg/cm2

30min（2）PDA培養(yǎng)基117整理課件

（3）淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號）配方如下：可溶性淀粉

20.0gKNO31.0gK2HPO40.5gMgSO4?7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4?7H2O0.01g瓊脂20g自來水1000mL滅菌：121℃15min

用于分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。118整理課件

無菌水為下一次微生物分離實驗中所需要的材料。100mL三角燒瓶（裝有玻璃珠），裝自來水45.0mL，試管中裝9.0mL自來水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角燒瓶和試管須預先塞好棉塞，并經干熱滅菌。無菌水的制備119整理課件

棉塞的制作

120整理課件培養(yǎng)基制備技術

----培養(yǎng)基分類根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質的化學成分是否完全了解來區(qū)分：１）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產廠或批號等因素的影響。２）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學成分精確、重復性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。３）半合成培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產實踐和實驗室中使用最多。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：１）液體培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。２）固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。３）半固體培養(yǎng)基如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2~1%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。121整理課件培養(yǎng)基制備技術

－－培養(yǎng)基的分類根