生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)第四章常用技術(shù)光譜分析技術(shù)吸收光譜發(fā)射光譜散射光譜電化學(xué)分析技術(shù)電泳技術(shù)層析技術(shù)離心技術(shù)可見光400~700nm,有色物質(zhì)溶液紫外光200~400nm,無色物質(zhì)CONTENTS目錄吸收光譜分析技術(shù)01發(fā)射光譜分析法02散射光譜分析法03電化學(xué)分析技術(shù)04電泳分析技術(shù)0501小節(jié)PART吸收光譜分析技術(shù)紫外紅外原子吸收可見吸收光譜比色分析法、可見光分光光度法0.575光源單色器吸收池檢測器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～1000氫燈、氘燈180～360濾光片棱鏡光柵玻璃比色皿石英比色皿當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，一部分光透過溶液。光吸收定律及適用范圍（一）吸光度與透光度設(shè)入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=I/I0T×100%為T%稱為百分透光度，透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度即：A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I入射光I0透射光I當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)；適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。（二）Lambert-Beer定律A=KLCA為吸光度K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)L為溶液層厚度，稱為光徑C為溶液濃度L在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對入射光的影響而用來調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液?？瞻兹芤旱倪x擇蒸餾水

試劑樣品不含待測元素不顯色溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機溶劑）作參比溶液。選擇原則：當(dāng)顯色劑及其它試劑均無色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用溶劑參比。試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。選擇原則：當(dāng)顯色劑本身有顏色或其它試劑有顏色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用試劑參比。樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。選擇原則：當(dāng)試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無顏色時，選用樣品空白。平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測元素的樣品進行平行操作，以消除操作過程中引入干擾雜質(zhì)所帶來的誤差。選擇原則：當(dāng)操作過程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測試樣組分的干擾離子。不顯色空白：可將一份試樣加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑和其它試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。選擇原則：當(dāng)顯色劑和被測試樣均有顏色時，可選用此法。定性分析定性鑒定純度鑒定結(jié)構(gòu)分析定量分析Lambert-Beer定律應(yīng)用定性依據(jù)：最大吸收波長λmax和摩爾吸光系數(shù)ε吸收光譜分析定量定性法（一）對未知化合物進行定性分析（二）對待測物質(zhì)進行定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將對應(yīng)各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測溶液測定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。01

5.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。對比法己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：CR=(AR×Cs)/As0202小節(jié)PART發(fā)射光譜分析法處于激發(fā)態(tài)的待測元素，原子回到基態(tài)時以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對元素進行定性與定量分析的方法。發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測器接收。火焰光度法熒光光度法火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測系統(tǒng)測量被測元素所發(fā)射的輻射強度來進行定量分析的方法，是一種簡化的發(fā)射光譜分析法。火焰光度法FP640火焰光度計火焰光度法分析示意圖火焰光度法的特點快速：試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測定準(zhǔn)確：火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析靈敏：分析堿金屬與堿土金屬，絕對靈敏度可達0．1～10×10－6g設(shè)備簡單：被測試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡單，且均在可見光區(qū)，故使譜線分離和測量的設(shè)備簡單應(yīng)用范圍窄：主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測定某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的光。熒光分光光度法指利用物質(zhì)吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對物質(zhì)定性或定量分析的方法。熒光分光光度法用于分析測定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等；對某些激素及其代謝產(chǎn)物的測定；當(dāng)化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時,使用熒光分析技術(shù)就能解決測定問題。熒光分光光度法化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光產(chǎn)生的原理03小節(jié)PART散射光譜分析法用單色光照射透明溶液時，大部分按原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。光的散射散射光譜分析法是利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴姸然?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進行定量分析的方法。散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測的光信號與儀器的檢測器有區(qū)別。2散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。1透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。04小節(jié)PART電化學(xué)分析技術(shù)電位分析法是利用電極電位與濃度的關(guān)系測定物質(zhì)含量的電化學(xué)分析方法。電位分析法——ISENernst方程式一類用特殊敏感膜制成，對溶液中某種特定離子有選擇性響應(yīng)的電化學(xué)傳感器離子選擇電極ISE離子活度：電解質(zhì)溶液中參與電化學(xué)反應(yīng)的離子的有效濃度離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測離子溶液分開，是電極的關(guān)鍵部位。ISE基本結(jié)構(gòu)內(nèi)參比電極電極殼體內(nèi)參比溶液敏感膜ISE結(jié)構(gòu)示意圖電極電位電極電位測量指示電極參比電極在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個電極，其中一個，其電位值隨待測離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測離子的濃(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。而另一個電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測量電位的標(biāo)準(zhǔn)，稱為參比電極(參考電極)。離子選擇性電極：電位法測定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測定離子的活度或濃度。電極電位測量電位分析法的特點選擇性好：在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對組成復(fù)雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測定。靈敏度高：電位法的檢出限為10-5～10-8mol/L，適于微量組分的測定，電位滴定法適于常量分析。快速：儀器設(shè)備簡單、操作方便、分析快速、測定范圍寬、不破壞試液，易于實現(xiàn)分析自動化。缺點：需要有專用的離子選擇性電極。根據(jù)國際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：pH玻璃電極是H+的指示電極，屬于非晶體電極。玻璃膜電極是電位法測定溶液pH的指示電極。其構(gòu)造如圖：下端部是由特殊成分的玻璃吹制而成的球狀薄膜。膜的厚度為0.1mm.玻璃管內(nèi)裝一定pH值（pH=7）的緩沖溶液和插入Ag/AgCl電極作為內(nèi)參比電極。玻璃膜電極原理：利用待測氣體對某一化學(xué)平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測定試液中被測氣體的分壓(含量)。如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測定時，CO2氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。（用pH玻璃電極間接測定CO2的含量）氣敏電極在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測量時，控制試液的酸堿度，使CO2通過氣透膜擴散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測定中介溶液的pH值，即可計算出試液中CO2的濃度。氣敏電極通過界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測定。氣敏電極端部裝有透氣膜，氣體可通過它進入管內(nèi)。管內(nèi)插入pH玻璃復(fù)合電極，復(fù)合電極是將外多比電極（Ag/AgCl）繞在電極周圍。管中充有電解液，也稱中介液。試樣中的氣體通過透氣膜進入中介液，引起電解液中離子活度變化，這種變化由復(fù)合電極進行檢測。如，CO2氣敏電極，用pH玻璃電極作為指示電極，中介液為0.01mol/L的碳酸氫鈉。二氧化碳與水作用生成碳酸，從而影響碳酸氫鈉的電離平衡來指示CO2。CO2+H2O===HCO3-+H+NH3+H2O===NH4++OH-SO2+H2O===HSO3-+H+2NO2+H2O===NO3-+NO2-+H+H2S+H2O===HS-+H3O+HCN+H2O===H3O++CN-HF+H2O===H3O++F-

可用電極測定的氣體凡是溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測。離子選擇性電極的分析方法直接法：樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測量離子活度。標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用測定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用離子計測定，繪制電極電位與活度對數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測定樣品，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得濃度。標(biāo)準(zhǔn)比較法標(biāo)準(zhǔn)加入法：將已知的小體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入已知較大體積的待測液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測液中被測離子得濃度。間接法：樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測量離子活度。電導(dǎo)分析法是利用電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來確定物質(zhì)含量的分析方法；是在外電場作用下以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離子遷移為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析法；是利用溶液的電導(dǎo)與溶液中離子數(shù)目的相關(guān)性建立分析方法。電導(dǎo)分析法什么是電導(dǎo)？衡量電解液導(dǎo)電能力的量度值電導(dǎo)是指電解質(zhì)溶液中正、負(fù)離子在外電場作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導(dǎo)導(dǎo)電能力與溶液中正負(fù)離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關(guān)干化學(xué)分析技術(shù)是將液體檢測樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測定樣品中特定成分的濃度或活動的一項技術(shù)；是以酶法為基礎(chǔ)的一類分析方法，又有干試劑化學(xué)或固相化學(xué)之稱。干化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測定方法不同，可將多層膜分為3種類型：熒光技術(shù)競爭免疫技術(shù)反射光度法差示電位法熒光反射光度法反射光度法漫反射光是指從光源發(fā)出的光進入樣品內(nèi)部，經(jīng)過多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表面的光。Kubelka—Munk理論描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學(xué)關(guān)系。朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關(guān)系差示電位法干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技術(shù)袋式分析儀05小節(jié)PART電泳分析技術(shù)電泳：帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析的技術(shù)電泳儀：可以實現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子電泳分析技術(shù)的基本原理兩性電離及