第五章生物工程技術(shù)基礎(chǔ)第一節(jié)基因工程第二節(jié)細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程第三節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)的特點第四節(jié)生物技術(shù)的一般應(yīng)用第五節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)的軍事應(yīng)用思考題上一頁

下一頁返回第一節(jié)基因工程一、基因工程的內(nèi)容

1基因工程概述

2目的基因的獲得

3基因工程的載體

4重組DNA分子的構(gòu)建

5重組DNA分子的導(dǎo)入

二、蛋白質(zhì)工程下一頁上一頁返回

1基因工程概述

基因工程是指按照人們的需要和設(shè)計，在體外將提取或者合成的目的基因與載體連接成為重組DNA分子，再將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物新的遺傳性狀?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰闹饕襟E包括：①從生物基因組中，經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶消化或PCR擴(kuò)增等方法，分離帶有目的基因的DNA片段；②在體外，用DNA連接將帶有目的基因的DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的載體上；③利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化等手段將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA分子或使其整合到受體細(xì)胞的染色體上；④篩選和鑒定出獲得重組DNA的受體細(xì)胞克隆。如果需要表達(dá)基因產(chǎn)物，還需要繼續(xù)完成以下兩個步驟：⑤從篩選出來的受體細(xì)胞克隆中分離已經(jīng)擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之表達(dá)出人類所需要的物質(zhì)。下一頁上一頁返回2目的基因的獲得(1)化學(xué)合成法(2)鳥槍法(3)反轉(zhuǎn)錄(4)PCR下一頁上一頁返回3基因工程的載體目的基因片段需連接到合適的載體中，才能被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞隨之繁殖而復(fù)制。載體是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運載工具，常用的載體有細(xì)菌質(zhì)粒、λ噬菌體、cosmid質(zhì)粒和人工染色體等。作為載體應(yīng)該具備以下幾個特征：①能夠自我復(fù)制或者能夠整合到受體細(xì)胞的染色體上，這樣才能保證目的基因的穩(wěn)定存在；②易于從寄主細(xì)胞分離純化；③載體DNA分子中有一段不影響自身擴(kuò)增的非必需區(qū)域，插在其中的外源基因可以像載體的正常組分一樣進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增。另外，載體還具有選擇標(biāo)記基因，便于重組細(xì)胞的篩選。下一頁上一頁返回4重組DNA分子的構(gòu)建(1)限制性核酸內(nèi)切酶(2)DNA連接酶(3)DNA片段的連接

下一頁上一頁返回5重組DNA分子的導(dǎo)入外源基因?qū)朐松锏淖畛Ｓ玫姆椒ㄊ抢寐然}誘導(dǎo)大腸桿菌感受態(tài)，即將大腸桿菌置于冰冷的氯化鈣溶液中，再經(jīng)過短暫的熱刺激，使外源基因易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。噬菌體載體攜帶外源基因以傳染的方式進(jìn)入受體細(xì)胞。此外，電穿孔法在原核生物中應(yīng)用十分普遍，它是采用脈沖高壓電瞬間擊穿細(xì)胞膜導(dǎo)入外源基因。轉(zhuǎn)基因的植物受體細(xì)胞多是除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，動物受體細(xì)胞是干細(xì)胞或卵細(xì)胞。外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的直接方法有：①基因槍法，用基因槍將表面帶有目的基因的金屬微粒射入動物細(xì)胞中；②顯微注射法，利用顯微注射儀直接將基因注入細(xì)胞中；③電穿孔法；④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，即以改造的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，這是植物基因工程最常用的方法。此外還有脂質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法等。下一頁上一頁返回二、蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程常常被稱為第二代基因工程。其基本內(nèi)容是指以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，通過化學(xué)和物理手段，對目的基因按預(yù)期設(shè)計進(jìn)行修飾和改造，合成新的蛋白質(zhì)；或者對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計、構(gòu)建和最終生產(chǎn)出比自然存在的蛋白質(zhì)功能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程的主要步驟有：①分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)；②測定氨基酸序列即一級結(jié)構(gòu)；③利用X射線晶體衍射和核磁共振等實驗手段，分析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；④涉及蛋白質(zhì)的改造方案；⑤對目的基因進(jìn)行定點突變，改變蛋白質(zhì)的單個或幾個氨基酸，使活性中心或蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，改造涉及載體、受體細(xì)胞等多種因素；⑥分離純化表達(dá)的蛋白質(zhì)并分析其功能，并評價其改造結(jié)果。

下一頁上一頁返回第二節(jié)細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程一、細(xì)胞工程二、轉(zhuǎn)基因動植物三、酶工程四、發(fā)酵工程下一頁上一頁返回一、細(xì)胞工程1細(xì)胞工程技術(shù)原理2細(xì)胞培養(yǎng)3細(xì)胞融合

下一頁上一頁返回1細(xì)胞工程技術(shù)原理細(xì)胞工程是生物工程的一個重要方面。它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。通過細(xì)胞工程可以生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品或培養(yǎng)有價值的植株，并可以產(chǎn)生新的物種或品系。根據(jù)設(shè)計要求，按照需要改造的遺傳物質(zhì)的不同操作層次，細(xì)胞工程可分為染色體工程、染色體組工程、細(xì)胞質(zhì)工程和細(xì)胞融合工程等幾個方面。

下一頁上一頁返回2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指動物細(xì)胞、植物和微生物細(xì)胞在體外條件下保存和生長。所有細(xì)胞培養(yǎng)的相同過程是：取材，進(jìn)行表面清洗和消毒，有的還需要酶處理以離散細(xì)胞；根據(jù)細(xì)胞的特點配置培養(yǎng)基；采用無菌操作技術(shù)將生物材料接種于培養(yǎng)基；最后進(jìn)行培養(yǎng)、傳代和收獲。

下一頁上一頁返回3細(xì)胞融合兩個或多個細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生融合、重排，導(dǎo)致細(xì)胞的合并、染色體等遺傳物質(zhì)的重組的過程稱為細(xì)胞融合。一般兩親本細(xì)胞或原生質(zhì)體在聚乙二醇誘導(dǎo)劑或電激下會發(fā)生融合，轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基上獲得具有雙親遺傳性狀的雜合細(xì)胞。下一頁上一頁返回

二、轉(zhuǎn)基因動植物1轉(zhuǎn)基因動物2轉(zhuǎn)基因植物3干細(xì)胞技術(shù)

下一頁上一頁返回1轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建是從細(xì)胞基因修飾開始。常見的建立轉(zhuǎn)基因動物方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法與干細(xì)胞法等。(1)顯微注射法(2)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法(3)胚胎干細(xì)胞(4)精子載體法(5)體細(xì)胞核移植法下一頁上一頁返回(1)顯微注射法利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源基因直接注入實驗動物的受精卵原核，使外源基因整合到動物基因組，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體的子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)而得到轉(zhuǎn)基因動物。這項技術(shù)開始于1980年初期的轉(zhuǎn)基因鼠，在20世紀(jì)80年代后期被應(yīng)用到大的家畜(如奶牛和奶山羊)等動物生物反應(yīng)器的構(gòu)建上。下一頁上一頁返回(2)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒可作為轉(zhuǎn)基因載體用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動植物。對于雞受精卵，無法對其進(jìn)行顯微注射操作，比較適合采用逆轉(zhuǎn)錄病毒的操作方式。但由于逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體具有潛在的致癌性，其載體的構(gòu)建較為復(fù)雜，容納外源基因的大小也有限，而且獲得的子代動物中嵌合體的比例大，使該技術(shù)的應(yīng)用受到了一定的限制。下一頁上一頁返回(3)胚胎干細(xì)胞在20世紀(jì)80年代中晚期，隨著轉(zhuǎn)基因動物體系的建立，胚胎干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)以及胚胎干細(xì)胞移植后體內(nèi)發(fā)育獲得了成功，胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)也不斷成熟，利用胚胎干細(xì)胞法建立轉(zhuǎn)基因動物取得了很大的進(jìn)展。

下一頁上一頁返回(4)精子載體法該方法是將外源基因與精子共同培養(yǎng)，再通過電穿孔或脂質(zhì)體介導(dǎo)等方法將外源基因?qū)氤墒斓木?，使精子攜帶的外源DNA進(jìn)入卵中并受精，從而使外源DNA整合到染色體中。由于這種方法相對簡單，利用人工授精過程就可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，因而成為近年來許多學(xué)者關(guān)注的焦點，特別是在大動物的轉(zhuǎn)基因研究上具有相當(dāng)重要的意義。

下一頁上一頁返回(5)體細(xì)胞核移植法該技術(shù)是以動物體細(xì)胞(包括動物成體體細(xì)胞、胎體成纖維細(xì)胞等)為受體，將目的基因?qū)肽軅鞔囵B(yǎng)的動物體細(xì)胞，再以這些動物體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動物克隆，進(jìn)而得到帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因克隆動物技術(shù)的采用，將基因轉(zhuǎn)移效率大為提高，轉(zhuǎn)基因動物后代數(shù)迅速擴(kuò)增，所需動物數(shù)大幅度降低。

下一頁上一頁返回轉(zhuǎn)基因鼠的構(gòu)建

下一頁上一頁返回圖描述了轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建實例，即將外來基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)成為其基因組的一部分。引入的基因(帶斑點皮毛)先被分離出來并設(shè)計使其攜帶適當(dāng)片段，然后將這段基因注入受精卵，方法如下：對一只雌鼠注射激素使其排出大量卵，隨后讓一只雄鼠與其交配使部分卵受精；將這些卵收集起來，在其受精卵分裂前注入外來基因(皮毛表達(dá)成斑點狀)物質(zhì)。這些轉(zhuǎn)基因的卵被移植入另一個雌性鼠體內(nèi)，在那里發(fā)育成型。由于某些卵內(nèi)基因物質(zhì)在隨意位點與染色體整合而成為老鼠細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，由這種卵發(fā)育成的動物將攜帶該基因從而成為皮毛呈斑點狀的轉(zhuǎn)基因鼠。下一頁上一頁返回2轉(zhuǎn)基因植物

與轉(zhuǎn)基因動物相類似，轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建也是從細(xì)胞基因修飾開始的。但是，植物細(xì)胞的生理特性不同于動物細(xì)胞，植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)也不一樣。轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法主要有農(nóng)桿菌導(dǎo)入法、基因槍法、花粉管通道法和原生質(zhì)體融合法等。(1)農(nóng)桿菌導(dǎo)入法(2)基因槍法(3)花粉管通道法(4)原生質(zhì)體融合法

下一頁上一頁返回(1)農(nóng)桿菌導(dǎo)入法農(nóng)桿菌介導(dǎo)所用的基因轉(zhuǎn)移根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌適用于雙子葉植物和部分裸子植物的轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建。最近研究顯示根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒也可向一些單子葉植物(如石萬柏、百合、薯蕷等)轉(zhuǎn)移外源基因并表達(dá)。先將帶目的基因的質(zhì)粒整合到農(nóng)桿菌基因組中，再將此農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共同培養(yǎng)36～48[KG*8]h，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，然后分離洗滌去菌后通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株或者形成冠癭瘤和發(fā)狀根等組織，所形成的腫瘤或發(fā)狀根本身即是一種天然的選擇標(biāo)記。野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒由于攜帶與生長素和細(xì)胞分裂素合成有關(guān)的基因，使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生過量的植物激素而形成腫瘤。利用這種野生型農(nóng)桿菌作為基因載體，常使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞喪失分化能力。發(fā)根農(nóng)桿菌感染后形成的發(fā)狀根可誘導(dǎo)再生形成植株。下一頁上一頁返回(2)基因槍法

這種方法用表面附著DNA分子(含目的基因)的金屬微粒，經(jīng)過加速裝置，轟擊植物細(xì)胞，將DNA直接射入植物細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率可達(dá)8％～10％。這種方法不受植物細(xì)胞種類限制，快速簡單，但設(shè)備昂貴。

下一頁上一頁返回(3)花粉管通道法將目的基因整合后，在植株開花時利用花粉管通道直接導(dǎo)入受體植株。這是由我國科學(xué)工作者發(fā)明的方法，主要用于棉花轉(zhuǎn)基因研究。其實，從本質(zhì)上講轉(zhuǎn)基因培育出來的品種與常規(guī)育種的品種的基因都發(fā)生了變化，只是方法路徑不同、精確程度不同而已。

下一頁上一頁返回(4)原生質(zhì)體融合法植物細(xì)胞在其原生質(zhì)體的外面有一層堅韌的細(xì)胞壁。要在植物細(xì)胞間進(jìn)行融合作用，首先必須設(shè)法除去細(xì)胞壁。稱去除細(xì)胞壁的細(xì)胞為原生質(zhì)體，它含有細(xì)胞組成的全部成分。原生質(zhì)體保持著植物細(xì)胞的全能性，在適宜的培養(yǎng)條件下，可以重新長出細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，形成完整的小植株。下一頁上一頁返回3干細(xì)胞技術(shù)

(1)干細(xì)胞分類

干細(xì)胞即未分化的細(xì)胞，是一類具有自我更新和分化發(fā)育潛能的原始細(xì)胞。機體的各種細(xì)胞、組織和器官甚至完整的生物都是通過干細(xì)胞分化發(fā)育而成的。干細(xì)胞分胚胎干細(xì)胞(ESC)和組織干細(xì)胞兩類。(2)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

下一頁上一頁返回胚胎干細(xì)胞的分離及分化

①—受精卵；②—胚囊階段(5～7天)；③—內(nèi)層干細(xì)胞團(tuán)；④—培養(yǎng)的未分化的干細(xì)胞；⑤—分化干細(xì)胞(a為血紅細(xì)胞，b為神經(jīng)細(xì)胞，c為肌肉細(xì)胞)

下一頁上一頁返回三、酶工程

酶工程主要是研究酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造以及在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用。1酶的固定化和固定化酶反應(yīng)器

2酶工程的應(yīng)用

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酶的固定化

與天然酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點：①可以重復(fù)多次使用，而且在大多數(shù)情況下，酶的穩(wěn)定性也有明顯改善；②催化反應(yīng)后，酶與底物以及產(chǎn)物容易分開，產(chǎn)物中沒有殘留酶，易于分離純化，使產(chǎn)品的質(zhì)量有大的提高；③反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)生物催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；④酶的利用效率高，單位酶量催化的底物量增加，而用酶量則大為減少；⑤比水溶性酶更適合于多酶催化反應(yīng)。固定化酶也帶來了一些問題和缺點，如：①在固定化過程中，總是有一部分酶會失活，其中以共價鍵法固定時造成的酶活損失最為嚴(yán)重；②酶被固定到載體后將增加底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力。

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酶的固定化

目前各種各樣的固定化方法，按所用載體和操作方法的差異，可分為載體結(jié)合法、包埋法和交聯(lián)法等三類，如圖所示。離子吸附法；(b)共價耦聯(lián)法；(c)交聯(lián)法；(d)聚合物包埋法；(e)疏水作用；(f)脂質(zhì)體包埋法；(g)微膠囊包埋法下一頁上一頁返回固定化酶反應(yīng)器各種類型的固定化酶反應(yīng)器間歇式攪拌罐式反應(yīng)器；(b)連續(xù)式攪拌罐式反應(yīng)器；(c)多級連續(xù)式攪拌罐式反應(yīng)器；(d)多級串聯(lián)半連續(xù)式操作反應(yīng)器；(e)填充床式反應(yīng)器；(f)帶循環(huán)的填充床式反應(yīng)器；(g)列管式填充床式反應(yīng)器；(h)流化床式反應(yīng)器；(i)攪拌罐-超濾器聯(lián)合反應(yīng)器；(j)環(huán)流式反應(yīng)器；(k)螺旋卷式生物膜反應(yīng)器下一頁上一頁返回2酶工程的應(yīng)用酶工程技術(shù)的應(yīng)用范圍大致有：①對生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)；②自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)；③酶的固定化技術(shù)(固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù))；④酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；⑤與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。實際上有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價值才真正得以體現(xiàn)?？梢院敛豢鋸埖卣f，人們的衣、食、住、行等幾乎都已經(jīng)離不開酶的應(yīng)用。下一頁上一頁返回四、發(fā)酵工程

發(fā)酵工程是生物技術(shù)的重要組成部分，是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)代發(fā)酵工程是將微生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)工程學(xué)有機地結(jié)合起來，利用微生物包括DNA重組技術(shù)改造的微生物生產(chǎn)有用物質(zhì)的工程技術(shù)。下一頁上一頁返回第三節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)的特點1原料簡單2反應(yīng)條件溫和3體系復(fù)雜運行可靠4特殊活性5系統(tǒng)緊湊6可提高或擴(kuò)展人的能力

下一頁上一頁返回第四節(jié)生物技術(shù)的一般應(yīng)用一、在生命科學(xué)中的應(yīng)用二、在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

1新藥開發(fā)

2疾病的預(yù)防、診斷和治療：

(1)疫苗(2)分子診斷(3)基因治療

3生物芯片技術(shù)三、在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用四、在能源與環(huán)境中的應(yīng)用

1能源利用和開發(fā)

2環(huán)境保護(hù)五、在工業(yè)上的應(yīng)用

下一頁上一頁返回第五節(jié)現(xiàn)代生物技術(shù)的軍事應(yīng)用一、軍用生物技術(shù)二、軍用生物技術(shù)的發(fā)展前景

下一頁上一頁返回一、軍用生物技術(shù)1軍用生物材料2軍用生物傳感器3軍用仿生技術(shù)

(1)仿生動力