毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)楊春燕2012.3.16前言毒理學(xué)：研究外源化學(xué)物與機(jī)體有害的交互作用毒理學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，其研究的主要手段是動物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：是以實(shí)驗(yàn)動物為模型，通過外源化學(xué)物對實(shí)驗(yàn)動物的毒性反應(yīng)，向人外推，以評估對人的危害及危險性體外實(shí)驗(yàn)：主要用于篩選和預(yù)測急性毒性和機(jī)制研究主要內(nèi)容毒理學(xué)毒性評價實(shí)驗(yàn)的基本目的2動物實(shí)驗(yàn)的職業(yè)道德3實(shí)驗(yàn)動物的選擇和管理4受試物樣品的準(zhǔn)備5毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計要點(diǎn)67毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ)8優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范9毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則和局限性1實(shí)驗(yàn)動物染毒和處置毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則和局限性

01.基本假設(shè)人是最敏感的動物人和實(shí)驗(yàn)動物的生物學(xué)過程與體重（或體表面積）相關(guān)

02.毒性試驗(yàn)的設(shè)計是為了最大限度的暴露化學(xué)品可能的毒性

03.外源化學(xué)物不同染毒途徑染毒實(shí)驗(yàn)動物所表現(xiàn)的毒性差異很大化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人成年的健康實(shí)驗(yàn)動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇實(shí)驗(yàn)動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人造成潛在危害的可靠方法Page

5動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推到人的不確定性132實(shí)驗(yàn)動物和人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，甚至存在質(zhì)的差別存在高劑量向低劑量外推的不確定性存在小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動物到大量人群外推的不確定性41實(shí)驗(yàn)動物對外源化學(xué)物的反應(yīng)單一Page

6毒理學(xué)毒性評價試驗(yàn)的基本目的2基本目的13受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量反應(yīng)（效應(yīng)）研究確定毒作用的靶器官4確定損害的可逆性動物實(shí)驗(yàn)的職業(yè)道德實(shí)驗(yàn)動物：包括所有脫離自然環(huán)境而用于研究、教學(xué)和試驗(yàn)的脊椎動物。所有的研究人員要尊重生命，善待實(shí)驗(yàn)動物。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)提倡和遵循‘3R’原則：替代replacement

減少reduction

優(yōu)化refinement實(shí)驗(yàn)動物的選擇和管理實(shí)驗(yàn)動物物種的選擇基本原則：1.對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種

2.選擇自然壽命不太長的物種

3.易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種

4.經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種Page

9犬、猴一般假設(shè)，如以與人相同的接觸方式、大致相同的劑量水平，在兩個物種有毒性反應(yīng)，則人有可能以相同的方式發(fā)生毒性反應(yīng)。當(dāng)不同物種的毒性反應(yīng)差異很大時，必須研究外源化學(xué)物在不同物種的代謝方式、動力學(xué)及毒作用機(jī)制，才可將實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人。大鼠、小鼠嚙齒類非嚙齒類2目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種實(shí)驗(yàn)動物品系的選擇品系：是實(shí)驗(yàn)動物學(xué)的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物品系分類：近交系、雜交群動物、封閉群Page

11開放系統(tǒng)屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)屏障系統(tǒng)隔離系統(tǒng)普通動物悉生動物SPF級動物無菌動物對實(shí)驗(yàn)動物微生物控制的選擇Page

12個體選擇年齡性別生理狀態(tài)健康狀況體重選擇健康動物，且動物進(jìn)夠后一般要進(jìn)行檢疫選擇未產(chǎn)未孕的雌性動物，且雌雄動物分籠飼養(yǎng)一般情況選擇雌雄各半個體選擇實(shí)驗(yàn)動物的管理在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中所用的實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)有：動物合格證實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證飼養(yǎng)合格證實(shí)驗(yàn)動物使用許可證受試物樣品的準(zhǔn)備受試物的純度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)（揮發(fā)性、溶解性、pH值等）、穩(wěn)定性（包括受試物在賦形劑中的穩(wěn)定性）。對各個毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該用同一種、同一批號受試物。試驗(yàn)所需受試物用量的計算所需受試物總量=（A×B×C×D)×1.2式中：A為每組動物數(shù)，B為各處理組的劑量和，C為染毒次數(shù)，D為動物的平均體重；1.2為安全因子，包含損耗量。試驗(yàn)前，應(yīng)將受試物制備成一定的劑型，再進(jìn)行給藥。常見的劑型有溶液、混懸液、膠囊等。常用的溶劑有蒸餾水、0.5%CMC、生理鹽水毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計要點(diǎn)（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）劑量分組劑量—反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，即當(dāng)外源化學(xué)物染毒劑量增加時，實(shí)驗(yàn)動物的毒性反應(yīng)（效應(yīng)）隨之增強(qiáng)。劑量—反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系的存在是確定外源化學(xué)物與有害作用因果關(guān)系的重要依據(jù)，也可證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。Page

17低、中、高劑量組的劑量一般按等比計算，劑量間距一般為2或出現(xiàn)明顯有害作用出現(xiàn)輕微毒性不出現(xiàn)任何可觀察到的毒性1234劑量設(shè)計對照組低劑量組中劑量組高劑量組Page

18未處理對照組（空白對照組）陰性（溶劑）對照組陽性對照組歷史性對照對照組設(shè)置實(shí)驗(yàn)動物染毒和處置實(shí)驗(yàn)動物染毒在毒性實(shí)驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。常用的染毒途徑有：經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同染毒途徑的吸收速率不同，一般為靜脈注射﹥吸入﹥肌肉注射﹥腹腔注射﹥皮下注射﹥經(jīng)口﹥皮內(nèi)注射﹥其他途徑（如經(jīng)皮等）。

1.經(jīng)口（胃腸道）染毒喂飼灌胃吞咽膠囊優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)稀釋毒性Page

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動式吸入染毒設(shè)備由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。將受試物注入氣管，使之分布至兩肺氣管內(nèi)注入動式吸入染毒（口鼻、整體）靜式吸入染毒2.

經(jīng)呼吸道染毒

3.經(jīng)皮膚染毒經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種：

一是經(jīng)皮染毒毒性實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠

二是皮膚刺激和致敏實(shí)驗(yàn)家兔、豚鼠被毛去除方法及要求

4.注射染毒常見的注射染毒方式：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射等。注射染毒注意問題：調(diào)整受試物的pH值，5～8

滲透壓，最好為等滲溶液靜脈注射應(yīng)該控制給藥速度注射前應(yīng)注意注射局部消毒

5.各種染毒途徑的最大容積實(shí)驗(yàn)動物生物標(biāo)本采集及處死

1.生物標(biāo)本采集

血液采集終末、非終末采血技術(shù)

糞便采集代謝籠采集

尿液采集代謝籠、膀胱穿刺術(shù)膽汁采集插膽管

2.麻醉

麻醉過程的注意事項

在麻醉過程中，必須確定麻醉深度；對麻醉動物多個系統(tǒng)（如：心率、脈搏、血壓、心電圖、體溫、呼吸頻率等）仔細(xì)監(jiān)測，并作出針對不同情況作出相應(yīng)措施。

常用的麻醉藥物

短效：乙醚

中效：賽拉嗪+氯胺酮

長效：戊巴比妥鈉

3.安死術(shù)

安死術(shù)：是指公認(rèn)的、以人道主義方法處死動物的過程，即沒有達(dá)到驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡。

常用的安死術(shù)：小鼠斷頭、脫頸、吸入過量CO2致死

大鼠斷頭、脫頸、吸入過量CO2致死

家兔腦定位擊打、戊巴比妥鈉麻醉后放血

犬、靈長類戊巴比妥鈉麻醉后放血4.病理解剖和標(biāo)本留取

大體解剖

大體解剖應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動物處死后半小時內(nèi)進(jìn)行；同時應(yīng)進(jìn)行主要臟器外形、大小、顏色、質(zhì)地等的大體觀察及記錄；對指定臟器稱重、計算臟器系數(shù)。

組織病理學(xué)檢查

對指定組織臟器取材、固定、制片，顯微鏡下觀察，并作出正確病理診斷。毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ)良好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計

統(tǒng)計學(xué)樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即處理組和對照組的非實(shí)驗(yàn)因素的條件均一性。因此，在動物分組及整個實(shí)驗(yàn)操作都應(yīng)遵循隨機(jī)化原則實(shí)驗(yàn)結(jié)果（指標(biāo)）的變量類型

數(shù)值變量（計量資料）分類變量（計數(shù)資料）不同變量選用不同的統(tǒng)計分析方法統(tǒng)計方法的選擇如果資料可擬合某些已知的分布，則適用于參數(shù)檢驗(yàn)，其敏感度和效率高于非參數(shù)檢驗(yàn)如資料不能擬合某些已知的分布，則應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)性和方差齊性如果任何變換都不能改善數(shù)據(jù)的分布，可能存在個別可疑值，應(yīng)予以識別和剔除另一方面，可使用不依賴總體分布模型的非參數(shù)統(tǒng)計分析在評價毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果時的3個問題是否具有統(tǒng)計學(xué)意義是否具有生物學(xué)意義，即是否是真實(shí)的效應(yīng)是否具有毒理學(xué)意義，即是否是有害效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義是具有生物學(xué)意義的必要條件之一判斷生物學(xué)意義的考慮步驟：縱向比較，此參數(shù)的改變有無劑量-反應(yīng)關(guān)系。如果存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，則認(rèn)為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關(guān)具有生物學(xué)意義。橫向比較，此參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變。與歷史性對