吸光光度法吸光光度法基本原理光度計及其基本部件顯色反應及顯色條件的選擇吸光度測定條件的選擇吸光光度法的應用紫外吸收光譜法簡介精1吸光光度法基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱之為吸光光度法。包括比色法可見分光光度法紫外分光光度法紅外光譜法精吸光光度法可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

精吸光光度法特點靈敏度高適用于微量組分的測定相對誤差約為2%一5%測定迅速儀器操作簡單價格便宜應用廣泛精吸光光度法/吸光光度法基本原理光的波段劃分

精吸光光度法/吸光光度法基本原理物質(zhì)對光的選擇性吸收當一束白光（由各種波長的光按一定比例組成）通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過。透射光（或反射光）刺激人眼而使人感覺到顏色的存在。因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。能夠組成白光的兩種光稱為補色光，兩種顏色互為補色。精吸光光度法/吸光光度法基本原理物質(zhì)顏色與吸收光頗色的互補關(guān)系精吸光光度法/吸光光度法基本原理當一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量被分子、原子所吸收，使這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)）M+熱M+熒光或磷光M+

h

M*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2精吸光光度法/吸光光度法基本原理物質(zhì)對光的選擇性吸收分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級，僅當照射光的光子能量與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當時才能發(fā)生吸收。不同的物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級，其能量差也不相同。所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性精吸光光度法/吸光光度法基本原理精吸光光度法/吸光光度法基本原理吸收曲線（吸收光譜）----物質(zhì)對不同波長光的吸收能力的描述以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖最大吸收波長----同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變在吸收峰及附近處的吸光度隨濃度增加而增大而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同精吸光光度法/吸光光度法基本原理精吸光光度法/吸光光度法基本原理定性分析----不同物質(zhì)其吸收曲線的形狀和最大吸收波長各不相同。根據(jù)這個特性可用作物質(zhì)的初步定性分析定量分析----不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰及附近處的吸光度隨濃度增加而增大。根據(jù)這個特性可對物質(zhì)定量分析。若在最大波長處側(cè)定吸光度，則靈敏度最高。吸收曲線是吸光光度法定量分析時選擇測定波長的重要依據(jù)。精吸光光度法/

朗伯一比爾定律

朗伯闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A∝b

（朗伯動畫1）（比耳動畫2）

比耳提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。A∝c

二者的結(jié)合稱為朗伯—比耳定律，其數(shù)學表達式為：

精吸光光度法/

朗伯一比爾定律A＝lg（I0/It)=kbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

k：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數(shù)，單位L·g－１·cm－１

a與k的關(guān)系為：a=k/M

（M為摩爾質(zhì)量）

精透光度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關(guān)系:

A

＝－lg

T

摩爾吸光系數(shù)k在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。吸光光度法/朗伯一比爾定律

/透光度(透光率)T精吸光光度法/

朗伯一比爾定律朗伯一比爾定律不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)（氣體或固體），是各類吸光光度法定量分析的依據(jù)K可作為定性鑒定的參數(shù)，也可用以估量定量方法的靈敏度：K值愈大，方法的靈敏度愈高。由實驗結(jié)果計算K

時，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，這樣計算的K值實際上是表觀摩爾吸收系數(shù)。精吸光光度法/

朗伯一比爾定律精吸光光度法/

朗伯一比爾定律/吸光度的加和性在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，這時體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性精吸光光度法/偏離比爾定律的原因在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質(zhì)濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。精吸光光度法/偏離比爾定律的原因非單色光引起的偏離朗伯-比爾定律只適用于單色光，但由于單色器色散能力的限制和出口狹縫需要保持一定的寬度，所以目前各種分光光度計得到的入射光實際上都是具有某一波段的復合光。由于物質(zhì)對不同波長光的吸收程度的不同，因而導致對朗伯－比爾定律的偏離。精吸光光度法/偏離比爾定律的原因/非單色光引起的偏離精吸光光度法/偏離比爾定律的原因/非單色光引起的偏離精吸光光度法/偏離比爾定律的原因/非單色光引起的偏離精吸光光度法/偏離比爾定律的原因/非單色光引起的偏離克服非單色光引起的偏離的措施使用比較好的單色器，從而獲得純度較高的“單色光”，使標準曲線有較寬的線性范圍。人射光波長選擇在被測物質(zhì)的最大吸收處，保證測定有較高的靈敏度，此處的吸收曲線較為平坦，在此最大吸收波長附近各波長的光的k值大體相等，由于非單色光引起的偏離要比在其他波長處小得多。測定時應選擇適當?shù)臐舛确秶刮舛茸x數(shù)在標準曲線的線性范圍內(nèi)。精吸光光度法/偏離比爾定律的原因/化學因素引起的偏離濃度高濃度時（通常＞0.01mol/L）由于吸光粒子間的平均距離減小，以致每個粒子都可影響其鄰近粒子的電荷分布，這種相互作用可使它們的吸光能力發(fā)生改變。由于相互作用的程度與濃度有關(guān)，隨濃度增大，吸光度與濃度間的關(guān)系就偏離線性關(guān)系。所以一般認為比爾定律僅適用于稀溶液。溶液中的吸光物質(zhì)常因解離、締合、形成新化合物或互變異構(gòu)等化學變化而改變其濃度，因而導致偏離朗伯—比爾定律。解離大部分有機酸堿的酸式、堿式對光有不同的吸收性質(zhì)，溶液的酸度不同，酸(堿)解離程度不同，導致酸式與堿式的比例改變，使溶液的吸光度發(fā)生改變。配合顯色劑與金屬離子生成的是多級配合物，且各級配合物對光的吸收性質(zhì)不同，例如在Fe(Ⅲ)與SCN-的配合物中，F(xiàn)e(SCN)3顏色最深，F(xiàn)e(SCN)2+顏色最淺，故SCN-濃度越大，溶液顏色越深，即吸光度越大。精