纖維素酶的檢測方法摘要：本文主要介紹了纖維素酶的降解原理，通過實(shí)驗(yàn)比較了四種常用纖維素酶的檢測方法的穩(wěn)定性，以及纖維素酶的發(fā)展前景，為纖維素酶的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：纖維素酶酶活測定葡萄糖回歸方程一、纖維素酶及其降解原理纖維素是高等植物細(xì)胞壁的主要成分，占植物總干重的30%-50%，是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生性碳源化合物，占地球總生物量的40%。據(jù)報(bào)道，我國每年光作物秸稈，稻梗等含纖維素較豐富的物質(zhì)就有5億噸之多，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的植物物質(zhì)高達(dá)噸，其中尚有89%未被人們利用，而大量的秸稈，稻梗等含纖維素豐富的物質(zhì)的利用率也很低。大多采用燃燒的方式來處理，這樣就造成了環(huán)境污染，破壞了土壤的理化性質(zhì)和喪失了有機(jī)質(zhì)成分。所以，纖維素的充分利用與有效的轉(zhuǎn)化對于解決當(dāng)前的能源危機(jī)，糧食短缺，環(huán)境污染等有重大意義。纖維素酶是分解纖維素的一類酶，它能將纖維素分解為葡萄糖，充分的利用了纖維素。自1906年Sellieres在蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，纖維素酶的研究和應(yīng)用受到了國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注，取得了很大進(jìn)展。目前，國內(nèi)外學(xué)者通過篩選產(chǎn)酶菌株來發(fā)酵產(chǎn)酶，再應(yīng)用纖維素酶到食品，醫(yī)藥，飼料，洗滌等工業(yè)中，不僅解決了纖維素的再利用問題還取得了很可觀的經(jīng)濟(jì)效益。纖維素酶是由許多具有高協(xié)同作用的水解酶組成的。習(xí)慣上將纖維素酶分成三種主要成分：內(nèi)切酶(內(nèi)切P-1,4-葡萄糖酶，也稱Cx酶)、外切酶(外切P-1,4葡萄糖酶，也稱C1酶)、p-1,4葡萄糖酶(即為纖維二糖酶)[1]C1酶主要作用于天然纖維素，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶的纖維素。Cx酶又分為Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一種內(nèi)斷型纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于P-(1,4)糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二塘。Cx2酶是一種外斷型纖維素酶，它從水合性纖維素分子的非還原端作用于P-(1,4)糖背鍵，逐步切斷P-(1,4)糖節(jié)鍵生成葡萄糖。纖維二糖酶則作用于纖維二糖，生成葡萄糖。纖維素酶在降解纖維素過程中的作用機(jī)理至今還不是很清楚。目前關(guān)于Cx酶、C1酶和P-1,4葡萄糖酶這3種酶的作用機(jī)理的假說比較公認(rèn)的是以下3種，其中協(xié)同理論最為廣泛接受。C1-Cx假說。該理論認(rèn)為首先由C1酶作用于纖維素酶的結(jié)晶區(qū)，再由外切酶和P-葡萄糖苷酶聯(lián)合作用產(chǎn)生二糖和葡萄糖。其水解模式如圖1所示。圖1C1-Cx假說示意順序作用假說。該假說認(rèn)為首先由內(nèi)切酶隨機(jī)的作用于纖維素的葡萄糖苷鍵，打開缺口，然后由外切酶在新生鍵末端切下一個(gè)纖維二糖，再由。-葡萄糖苷酶將它水解成葡萄糖。協(xié)同作用假說。該理論認(rèn)為是內(nèi)切葡萄糖酶首先進(jìn)攻纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，。-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位形成葡萄糖。二、纖維素酶的檢測方法纖維素酶各組分的底物專一性不同，而且纖維素酶是多組分復(fù)合物。纖維素酶作用的底物也比較復(fù)雜，同時(shí)不同來源的纖維素酶其組成及各組分的比例有較大的差異，致使纖維素酶活力的測定方法復(fù)雜而不統(tǒng)一。其中主要的檢測方法有：棉線切斷法，濾紙崩潰法，羧甲基纖維素鈉為底物的粘度減少和還原糖增加的測定法⑵，分光光度計(jì)法⑶，快速測定纖維素酶CMC液化活力法⑷，平板法，巴魯阿-斯溫(Bamchandswain)測定法⑸。對于細(xì)菌等對纖維素分解能力強(qiáng)的微生物，由于對其酶的形成、分泌和作用機(jī)制研究較少,這些測定方法不一定適用。但目前對于這些方法測定的具體數(shù)值的可信度、可比性，卻沒有相關(guān)的報(bào)道研究。下面主要通過四種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究這些實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，從而為實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考依據(jù)⑹。、材料與方法材料:主要儀器HH-6型恒溫水浴鍋;22PC型分光光度計(jì)；HG1001型電熱鼓風(fēng)干燥箱;FA2004型電子分析天平；UV-2401型紫外雙光束分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)方法：試劑的配置：(1)醋酸-醋酸鈉緩沖液：冰醋酸定容至100ml，稱取27,2g的醋酸鈉溶解并定容至100ml將上述兩種溶液等體積混合。(2)3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)：稱取3,5-二硝基水楊酸于500ml大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/mlNaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后移入1000ml容量瓶中，用蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。（3）CMC-Na溶液：稱取羧甲基纖維素鈉，加熱溶解，定容至100ml"］。酶活測定方法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制原理：3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的強(qiáng)度成比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)測出其在520nm處的吸光度，得出還原糖的量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將葡萄糖放在110°C烘箱中烘2h至恒重，稱取烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。取16支具塞試管，依次編號為0,1,2,3,4,5,6,7并作平行實(shí)驗(yàn)。由于各種方法反應(yīng)體系的總體積不同，所以需作不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所加的量也有所不同?，F(xiàn)以總體積為9ml體系為例：表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法管號01234567葡萄糖量（ml）0123蒸餾水（ml）7654DNS(ml)22222222搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25ml。搖勻后以0號管為對照于最大吸收波長處測定OD值，以葡萄糖含量nmol為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活測定方法的比較配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酶液：用去離子水100ml來溶解100mg纖維素酶（N1000山），配制成1mg/ml酶液。測定時(shí)分別吸取，，，，，上述酶液用水補(bǔ)足至1ml即為不同濃度的酶液。（1）濾紙酶活（FPA）測定方法濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法，此方法應(yīng)用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活（FilterPaperActivity,FPA）方法：取1ml酶液加1mlL、的醋酸緩沖液，預(yù)熱到50C，加入1條1x6cm新華濾紙（50±1mg）,50C保溫1h。取出，沸水浴滅活5min，冷卻至室溫，用3mlDNS試劑顯色后稀釋3倍，測OD值（520nm）。OD值越大，說明該菌株的酶活力越強(qiáng)⑻。酶活力計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖口mol數(shù);期活力＜|J/rn)其中：60為保溫時(shí)間（酶與底物作用時(shí)間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；口是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1口mol葡萄糖的酶量。（2）羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）酶活性測定方法原理：纖維素酶對CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)液，22PC分光光度計(jì)在520nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當(dāng)于1口mol的葡萄糖為一個(gè)酶活性單位。取3支帶有20ml刻度的試管，1支管作空白對照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1ml酶溶液，置于50°C水浴鍋中預(yù)熱2min，然后在3支試管中分別加入4ml已預(yù)熱至50°C的底物溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5min取出，每管立即分別加入1ml2mol/L氫氧化鈉溶液和2mlDNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1ml酶液。將3支試管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20ml，于520nm處測OD值。酶活力計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖口mol數(shù)；期活力＜ ； -5x項(xiàng)其中：5為保溫時(shí)間（酶與底物作用時(shí)間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；口是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1口mol葡萄糖的酶量。（3）染色纖維素測定方法[9]用考馬斯亮藍(lán)使濾紙染色酶解后在最大吸收波長處測釋放的著色物的吸光值，代表酶活，以吸光度為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)做曲線。在實(shí)際測定時(shí)，先利用紫外雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在536nm處吸收峰最高，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)以此波長作為測定波長。（4） CMC粘度降低測定方法底物溶液9ml,加酶液1ml,40C，測定底物粘度減至一半時(shí)所需時(shí)間，以奧氏粘度計(jì)測定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作為一個(gè)單位。結(jié)果與分析葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線繪制結(jié)果如下：由于在以后的測定中，各方法的反應(yīng)體系并不相同，所以每個(gè)體系須有各自的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線作為今后的參照。CMC糖化力測定參照圖1,

有三條曲線，是因?yàn)樵诔Ｓ脺y定中酶與底物不同，而造成它們各自體系的溶液的總體積也不相同，因此此方法的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線有三條。濾紙法參照圖2。葡確鐳含yU圖1CMC酶活測定法葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（不同體系）所得三條曲線的回歸方程如下：y1=蝕餐*含最〈Ume1>圖2濾紙法葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線所得曲線的回歸方程：y二標(biāo)準(zhǔn)纖維素酶酶活曲線酶活測定方法結(jié)果比較如下：表2標(biāo)準(zhǔn)纖維素的CMC酶活力和濾紙酶活力測定結(jié)果CMC酶活力測定法 濾紙酶活力測定法（FPA）含酶量 查得葡萄糖 查得葡萄糖（/L）OD值量（°酶活（U/mL）OD值量（°酶活（U/mL）0 0 0 0 0 0 0

之一fst-O-02所得曲線的回歸方程:0^5o-00s<1.s之一fst-O-02所得曲線的回歸方程:0^5o-00s<1.sy= R2=y= R2二實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用標(biāo)準(zhǔn)纖維素酶所做的CMC酶活測定和濾紙酶活測定，從回歸曲線可以看出他們的線性較好，可以充分說明這2種方法比較穩(wěn)定。而且CMC酶活測定法和濾紙酶活測定法在很多報(bào)道中均在采用，這樣使實(shí)際實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更具可比性。所得曲線的回歸方程：y二所得曲線的回歸方程:y二由上述結(jié)果可知:CMC粘度降低法的線性沒有濾紙酶活測定法和CMC酶活測定法來得好,而且在實(shí)驗(yàn)過程中，兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)之間有較大的誤差。但從回歸方程就能看出，該方法的穩(wěn)定性較其他3種方法有很大的偏差。表3標(biāo)準(zhǔn)纖維素的CMC粘度降低法和染色纖維素法測定結(jié)果染色纖維素法CMC粘度降低法

染色纖維素法含酶量（mg/mL） 所用時(shí)間（min） 含酶量（mg/mL） 所用時(shí)間（min） 酶活（U/mL）OD值酶量（mg）結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)研究了纖維素酶測定方法中常用的4種方法，即：FPA測定法、CMC-Na酶活性測定法、染色纖維素測定法以及CMC粘度降低測定法，比較了這4種方法測定的線性相關(guān)性以及穩(wěn)定性，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)PA測定法和CMC-Na酶活性測定法較穩(wěn)定，線性相關(guān)性較高，可以作為研究測定的可靠方法。三、纖維素酶的應(yīng)用與發(fā)展趨勢纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙、和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上具有重要地位。自20世紀(jì)90年代開始，酸性纖維素酶用于牛仔布的水洗整理 （biostoningandbiofinishing），從而開始了纖維素酶在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，這也是目前纖維素酶應(yīng)用最成功、用量最大的領(lǐng)域。在牛仔布的水洗整理上酸性纖維素酶具有用量少、效果快的特點(diǎn)，但服裝返染嚴(yán)重；中性纖維素酶反應(yīng)條件溫和而且不易返染，織物檔次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉織物的整理上，如去球(depilling)脫毛(reducedfuzz)以及增柔(softness)等，酸性纖維素酶特別是木霉產(chǎn)生的纖維素酶仍具有更多的優(yōu)勢。利用纖維素酶對棉織物的整理并不需要纖維素酶的所有組分，如進(jìn)行棉織物的脫毛、去球等整理，僅有內(nèi)切酶就可產(chǎn)生明顯的效果，但是棉織物的減量也較嚴(yán)重，影響了織物的強(qiáng)度，通過基因工程改變內(nèi)切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解決這個(gè)問題。纖維素酶用于造紙工業(yè)，是利用外切纖維素酶只從末端切斷纖維素的作用原理，提高紙張的光潔度。堿性纖維素酶用于洗滌劑工業(yè)，可以提高棉織物的洗凈度，起主要作用的是內(nèi)切酶(CMC酶)，是近些年來洗滌劑工業(yè)競相開發(fā)的新酶種之一。這兩種工業(yè)應(yīng)用涉及的纖維素酶只需要纖維素酶系中的單一組分，基因工程技術(shù)可以在其中得到廣泛的應(yīng)用。纖維素酶將來最大的用途，或者可以使其產(chǎn)量得到巨大增長的工業(yè)需求將是纖維素乙醇的開發(fā)。自上世紀(jì)70年代石油危機(jī)以來，世界各國都致力于開發(fā)新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。進(jìn)入21世紀(jì)，利用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖進(jìn)而發(fā)酵獲得生物乙醇，可以避免對糧食作物的大量損耗，引起了各國政府和研究機(jī)構(gòu)的重視，這其中的關(guān)鍵是纖維素酶的成本問題。由于纖維素酶發(fā)酵活力較低，因此其應(yīng)用成本也較高。同時(shí)纖維素酶相比其他糖苷水解酶類，比活力至少要低1~2個(gè)數(shù)量級，如濾紙酶的比活力為1山/mg左右，CMC的比活力約為10山/mg，從而造成酶的作用效率較低。這是兩個(gè)限制纖維素酶應(yīng)用的瓶頸問題，也是纖維素酶研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。目前通過傳統(tǒng)的菌種誘變和基因工程技術(shù)可以較大幅度地提高目的蛋白的表達(dá)量，從而提高酶的發(fā)酵水平，如諾維信公司與美國能源部合作，將制造纖維素乙醇中的酶制劑成本由2001年的每加侖5美元降低到2004年的30美分，2005年又降低到每加侖18美分。還可以通過改善發(fā)酵條件和工藝，如采用固體發(fā)酵來大幅度降低發(fā)酵成本。但是提高酶降解天然纖維素的效率則需要，深入研究纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能以及作用方式，進(jìn)而對其進(jìn)行有效改造;或者通過篩選新的產(chǎn)酶菌種，發(fā)現(xiàn)具