微生物檢驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)把控湖南省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)教研室黃露萍2標(biāo)本采集與運(yùn)送環(huán)節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)涂片、染色、鏡檢技術(shù)規(guī)范一、標(biāo)本采集和運(yùn)送標(biāo)本采集和運(yùn)送是細(xì)菌培養(yǎng)成功的最最重要的環(huán)節(jié)由于標(biāo)本的采集和運(yùn)送常有護(hù)士或醫(yī)生或病人自己完成，所以也是最不容易把控的環(huán)節(jié)造成的后果是：陽性率低、假陽性（污染造成，對病人危害最大）（一）痰標(biāo)本的采集采集時(shí)間：用抗生素前采集方法：1.咳痰：

咳痰前,患者用無菌生理鹽水漱口；咳出深部痰，勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。

2.氣管吸出物:當(dāng)氣管插管的患者出現(xiàn)肺炎癥狀時(shí)，從氣管中吸痰留取氣管吸出物標(biāo)本。3.氣管鏡：可采集到感染部位高質(zhì)量的標(biāo)本，包括支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本（BAL）、支氣管灌洗液標(biāo)本(BS)、保護(hù)毛刷標(biāo)本（PSB）及支氣管穿刺活檢標(biāo)本，均由呼吸科醫(yī)生或經(jīng)培訓(xùn)醫(yī)生采集。4.誘導(dǎo)痰（通常不用于細(xì)菌培養(yǎng)）標(biāo)本運(yùn)送：在1h-2h內(nèi)室溫關(guān)至微生物室驗(yàn)室。

篩選并拒收下呼吸道細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本拒收24h內(nèi)重復(fù)采集的痰細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本。唾液。鼻沖洗液和分泌物、鼻孔拭子。咽部標(biāo)本。未經(jīng)保護(hù)套管收集的支氣管刷培養(yǎng)標(biāo)本。痰的厭氧菌培養(yǎng)標(biāo)本。除支氣管穿刺吸出物、PSP、活檢標(biāo)本、胸水或其他末經(jīng)污染以外的標(biāo)本做厭氧菌培養(yǎng)均不合格。誘導(dǎo)痰：此標(biāo)本只適用于檢測卡氏肺孢子菌和結(jié)核分枝桿菌，對其他病原菌檢出效果差。（二）泌尿標(biāo)本的采集采集時(shí)間：多數(shù)藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應(yīng)在用藥前采集，標(biāo)本管不應(yīng)含防腐劑和消毒劑。要盡量采集晨尿，使尿液在膀胱內(nèi)潴留一夜或潴留至少4h以上，這樣可降低假陰性率。恥骨弓上穿刺采集尿-此法為“金標(biāo)準(zhǔn)”。直接膀胱導(dǎo)尿，可導(dǎo)致繼發(fā)性感染，一般不推薦此法清潔中段尿：采集中段尿時(shí)要先用肥皂清洗女性的外陰和男性的外生殖器包括包皮內(nèi)，然后用清水沖洗。長期留置導(dǎo)尿管的患者應(yīng)在更換新管時(shí)留取尿標(biāo)本。兒童尿液采集袋：此法培養(yǎng)結(jié)果陰性更有意義。采集后的標(biāo)本應(yīng)立即送檢，不能2h送到的尿標(biāo)本，在保存和運(yùn)送中均需要4℃冷藏，且不能超過24小時(shí)。尿液標(biāo)本拒收超過2h而未冷藏的尿液標(biāo)本。未提供采集時(shí)間及采集方法的尿液標(biāo)本。過夜的標(biāo)本。不適于尿道感染診斷的導(dǎo)尿管尖的培養(yǎng)。來自導(dǎo)尿患者尿袋中的尿液。送檢時(shí)容器有滲漏的尿液。除恥骨弓上穿刺采集標(biāo)本以外的申請做厭氧菌培養(yǎng)的尿液。如果以上不合格標(biāo)本臨床要求必須培養(yǎng)時(shí)，要求在報(bào)告中注明，并強(qiáng)調(diào)此培養(yǎng)結(jié)果僅供參考。（三）分泌物的采集1、對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。（三）分泌物的采集2、閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時(shí)送檢應(yīng)運(yùn)用輸送培養(yǎng)基。（四）便標(biāo)本的采集1、采集時(shí)間：腹瀉患者應(yīng)在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應(yīng)在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2、采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內(nèi)或直接盛于增菌液或保存液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培養(yǎng)基中送檢。（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集1、采血時(shí)間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2、采血量：采一次或采一瓶是錯(cuò)誤的，至少應(yīng)采一套2瓶，分需氧和厭氧。2瓶血量不少于16-20ml，先將10ml注入需氧瓶，再將剩余血采血注入?yún)捬跗俊?、采血方法：不要與血?dú)夂脱翗?biāo)本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口采血。（五）血液及骨髓標(biāo)本的采集4、采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培養(yǎng)標(biāo)本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥。5、兒童：采血量是總血量的1%。6、延遲培養(yǎng)瓶處理:延遲培養(yǎng)瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細(xì)菌室。7、皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。關(guān)于夜班血培養(yǎng)的送檢培養(yǎng)瓶夜班未能及時(shí)送到檢驗(yàn)科，存在室溫即可，不能冷藏也不能放入35℃的溫箱。過夜不會對檢測造成影響，但仍需盡快送檢。冷藏可能導(dǎo)致對溫度敏感的耐瑟氏菌等死亡。溫箱會導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入生長對數(shù)期，從而錯(cuò)過檢測的最佳時(shí)期。血標(biāo)本采集間隔時(shí)間對于非持續(xù)性菌血癥，同時(shí)或短時(shí)間內(nèi)采集2－3套血培養(yǎng)，因?yàn)轶w內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)會在15～30min內(nèi)清除掉進(jìn)入人體內(nèi)的細(xì)菌?？梢杉毙孕膬?nèi)膜炎患者要立即取血作血培養(yǎng)，30分鐘內(nèi)完成3套血培養(yǎng)的采集，采集后立即進(jìn)行抗菌藥的經(jīng)驗(yàn)治療。如果24小時(shí)內(nèi)報(bào)告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)?？梢傻膩喖毙孕膬?nèi)膜炎患者每間隔30分鐘至1h采集1套，連續(xù)采集3套標(biāo)本。如果24小時(shí)內(nèi)報(bào)告陰性，則繼續(xù)采集2套血培養(yǎng)。腦脊液標(biāo)本的采集無菌操作，由醫(yī)生腰椎穿刺采樣最少1mL，最好>5mL打入3個(gè)小管中，以第一根小管送檢培養(yǎng)即時(shí)送檢，一般不能超過1小時(shí)。絕對不能冷藏！

二、分離培養(yǎng)基本操作規(guī)范

合格的標(biāo)本是保證培養(yǎng)成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境以及正確的處理方法同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本操作規(guī)范以保證致病細(xì)菌分離成功。（一）平板的劃線分離方法171819分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)圖示2023/7/3122連續(xù)劃線法Maki滾動(dòng)法24錯(cuò)誤涂法（二）正確的培養(yǎng)基放置方法1、加蓋、倒置（底朝上）3、放置于合適的培養(yǎng)環(huán)境2、不可疊加太高（不超過4個(gè)）

（三）各種標(biāo)本的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1、痰標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基置35℃空氣培養(yǎng)。⑶真菌培養(yǎng)：沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，28℃空氣培養(yǎng)。2、尿標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭、伊紅美藍(lán)瓊脂或CLED平板。⑵菌落計(jì)數(shù)：每個(gè)標(biāo)本都要做，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本10ul分別接種于上述培養(yǎng)基均勻涂布整個(gè)平皿，次日作菌落計(jì)數(shù)。⑶培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)3、大便標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：中國蘭、SS瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。⑶疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂，5%羊血瓊脂置35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。沙保弱瓊脂置28℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。其他特殊腸道致病菌培養(yǎng)按國家CDC要求執(zhí)行。

4、分泌物標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。5、靜脈導(dǎo)管尖端標(biāo)本

靜脈導(dǎo)管尖端：

培養(yǎng)靜脈導(dǎo)管尖端是為了明確細(xì)菌來源。最常用的方法是半定量的方法，方法是用5cm長的導(dǎo)管末端部分在血液瓊脂平板上滾動(dòng)4次。培養(yǎng)物出現(xiàn)15個(gè)以上的菌落，提示有潛在的導(dǎo)管相關(guān)性感染。6、腦脊液標(biāo)本⑴

培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、葡萄糖肉湯⑵培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。7、膽汁或胸水或腹水標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：如標(biāo)本量大時(shí)可按血液培養(yǎng)方法直接取16-20ml分別種入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。如標(biāo)本量有限，可接種5%羊血瓊脂、中國蘭、葡萄糖肉湯。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。8、膿液標(biāo)本⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭。⑵培養(yǎng)環(huán)境：35℃，空氣環(huán)境培養(yǎng)。9、生殖道標(biāo)本普通細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本接種：

⑴培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂和5%兔血巧克力瓊脂。⑵培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。淋球菌標(biāo)本的接種：

⑴培養(yǎng)基：接種于專用MTM平皿上。⑵培養(yǎng)環(huán)境：置5%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)。3637三、細(xì)菌涂片、染色與鏡檢操作規(guī)范58痰標(biāo)本報(bào)告原則a)白細(xì)胞和優(yōu)勢菌（不粘附在鱗狀上皮細(xì)胞上）有助于預(yù)測肺部致病菌，應(yīng)該報(bào)告；b)每個(gè)油鏡視野可見大于10個(gè)或小于10個(gè)單一形態(tài)細(xì)菌并與白細(xì)胞相關(guān)，有助于預(yù)測肺部致病菌，應(yīng)該報(bào)告；涂片中少于1個(gè)菌/20個(gè)油鏡視野的少量細(xì)菌不必報(bào)告；c)雖然由兩種致病菌同時(shí)引起的感染不常見，但當(dāng)兩種形態(tài)的細(xì)菌均與白細(xì)胞相關(guān)時(shí)也應(yīng)報(bào)告；d)即使涂片未見細(xì)菌時(shí)仍有助于評價(jià)患者狀況，可能隱藏著某些特殊菌，如軍團(tuán)菌、內(nèi)源性真菌、結(jié)核分枝桿菌或其他可引起非典型肺炎的致病菌；e)質(zhì)量合格的標(biāo)本中，涂片有正常菌群及多種細(xì)菌（通常白細(xì)胞內(nèi)有空泡或液泡），提示有吸入性肺炎，應(yīng)該報(bào)告。60顯微鏡觀察革蘭染色結(jié)果

痰涂片在低倍物鏡下檢測20個(gè)～40個(gè)視野，氣管吸出物涂片分別在低倍鏡視野（LPF）和油鏡視野（OIF）下觀察。計(jì)算有細(xì)胞視野的細(xì)胞平均數(shù)量，記錄鱗狀上皮細(xì)胞（SECs）和多形核白細(xì)胞（WBCs)的數(shù)量。注1：低倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)：1+（偶見）：少于1個(gè)/LPF；2+（少量）：1個(gè)～9個(gè)/LPF；3+（中量）：10個(gè)～25個(gè)/LPF；4+（大量）：大于25個(gè)/LPF.注2：油鏡下細(xì)菌計(jì)數(shù)：1+（偶見）：少于1個(gè)/OIF；2+（少量）：1個(gè)～5個(gè)/OIF；3+（中量）：6個(gè)～30個(gè)/OIF；4+（大量）：大于30個(gè)/OIF.抗酸染色抗酸染色原理:分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達(dá)到染色目的。621、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定抗酸染色染色步驟63抗酸染色步驟2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步。

沖洗干燥油鏡觀察石炭酸復(fù)紅維持3-5’3%鹽酸酒精30’’~1’美藍(lán)復(fù)染1’沖洗沖洗初染脫色復(fù)染64抗酸菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。

抗酸染色注意事項(xiàng)①無菌操作②涂片厚度要適中③染色時(shí)間要充分④脫色是關(guān)鍵步驟，要徹底⑤初染加熱勿沸騰勿干涸。形態(tài)：細(xì)長，略彎曲的桿菌，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶可見呈分枝狀生長，無鞭毛和芽胞。染色性：不易著色，抗酸染色陽性。菌體呈紅色，背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌69涂片結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)陰性300視野0條報(bào)告菌數(shù)300視野1～8條陽性1＋100視野3～9條陽性2＋10視野1～9條陽性3＋每視野1～9條陽性4＋每視野>10條抗酸染色涂片結(jié)果報(bào)告抗酸染色報(bào)告應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報(bào)告中應(yīng)以加號體現(xiàn)標(biāo)本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標(biāo)本。不能報(bào)告找到結(jié)核桿菌但可報(bào)告未找到結(jié)核桿菌71結(jié)核菌檢測方法抗酸染色結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)核桿菌血清學(xué)檢查結(jié)核桿菌的抗原、抗體檢查結(jié)核桿菌基因檢測（PCR）7273墨汁負(fù)染色目的

墨汁負(fù)染色法觀察新型隱球菌的形態(tài)。原理新型隱球菌的莢膜較厚，一般不易著色，同時(shí)菌體折光性較強(qiáng)，用墨汁負(fù)染色法可在黑色背景下看到透亮菌體。墨汁染色染色步驟取腦脊液第一管標(biāo)本3000r離心15分鐘，移去上清液，試管內(nèi)留下0.5ml左右，混勻。分別取2滴混勻了的腦脊液和1滴墨汁放入清潔小試管底部，混勻。取一張清潔載玻片，把2滴腦脊液和1滴墨汁的混合物混勻放在載玻片，把蓋玻片覆蓋于菌液上，避免產(chǎn)生氣泡。放置2分鐘左右后鏡檢。墨汁負(fù)染色法鏡檢隱球菌可于黑色背景下見一圓形或卵圓形透亮菌體，外有一層透明的寬厚莢膜，莢膜較菌體大1-3倍，折光性強(qiáng)。急球菌大小不一，有的孢子生芽，芽頸甚細(xì)。微調(diào)觀察有雙圈。在低倍鏡下，把光線調(diào)暗，并調(diào)整微調(diào)，能清楚看到菌體有雙層反射光圈。菌體次中央或偏側(cè)有一空泡。新型隱球菌形態(tài)酵母菌，芽生繁殖在腦脊液、痰液組織中呈圓形或板圓形，直徑約5—20μm，四周包括肥厚的膠質(zhì)樣夾膜。77墨汁負(fù)染色法結(jié)果的觀察78墨汁染色注意事項(xiàng)注意先將蓋玻片一邊