第十二第十二章固相膜免疫測定第十二第十二章固相膜免疫測定1隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標準。隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上2

第一節(jié)概述標記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學(xué)發(fā)光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－第一節(jié)概述3一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+AbAgAb+Ab標記免疫測定Ag+Ab*AgAb*+Ab*（B）（F）一、免疫測定分類免疫濁度測定4二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復(fù)合物Ag+AbAg*Ab二、免疫測定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測標本中微量物質(zhì)5三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb三、固相免疫測定B與F分離Ab*6四、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便四、固相膜的特點7五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜8六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm9第二節(jié)免疫金標記技術(shù)

免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。第二節(jié)免疫金標記技術(shù)免疫金標記技術(shù)(Immuno10一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（goldsolution）。一、膠體金制備膠體金（colloidalgold）的制備11膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（12膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)膠體金（ColloidalGold）

15~60n13膠體金結(jié)合物（Conjugate）膠體金結(jié)合物（Conjugate）14膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志心肌標志濫用藥物膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不15固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunog16一、免疫滲濾測定(IFA)一、免疫滲濾測定(IFA)17IFA——雙抗體夾心法測抗原ABIFA——雙抗體夾心法測抗原AB18IFA——結(jié)果判斷IFA——結(jié)果判斷19二、免疫層析測定（ICA）二、免疫層析測定（ICA）20ICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊ICA試劑條樣結(jié)NC吸21ICA——雙抗體夾心法測抗原ICA——雙抗體夾心法測抗原22ICA——間接法測抗體ICA——間接法測抗體23ICA結(jié)果觀察

陽性陰性無效ICA結(jié)果觀察陽性陰性無效24IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試25IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）IFA26GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測27GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代1988HIVCHEK（DuPont）單點，5~10分鐘，血清，金標試劑瓶裝凍干品改進抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應(yīng)時間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點（測試+控制）金標試劑：單人份、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代研制中單一試劑GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代HIVCHEK（DuPont28ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml合成TnT質(zhì)控點ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒29IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔C：定量質(zhì)控100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線半定量測定IFAIFAICASCT測對半定量測定30三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA31四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，32ELISPOT檢測原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過CTL公司生產(chǎn)的ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。ELISPOT檢測原理細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞33固相膜免疫測定課件34ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有T細胞研究價值）斑點大小的意義在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸如何從單個細胞基礎(chǔ)上分析實驗精確度有多高？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果？幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義？ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T35ELISAPOTELISAPOT36ELISPOT結(jié)果判斷ELISPOT結(jié)果判斷37五、免疫印跡法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢五、免疫印跡法——Westernblot法原理Western38六、放射免疫沉淀試驗原理放射免疫沉淀試驗——抗原表位不會破壞六、放射免疫沉淀