生技11發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方案

生技11、專(zhuān)升本13發(fā)酵試驗(yàn)方案試驗(yàn)一中草藥梔子活性成分京尼平苷轉(zhuǎn)化菌篩選〔細(xì)菌〕原理:利用京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后產(chǎn)生京尼平與谷氨酸反響生成藍(lán)色。

通過(guò)平板顏色變化來(lái)推斷是否存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。

材料與儀器:主要儀器設(shè)備:超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培育箱、電子天平、250三角瓶、培育皿、移液管、移液槍、移液槍盒、藍(lán)蓋瓶、涂布棒、接種環(huán)〔針〕、1000燒杯、100燒杯、玻璃棒、離心管、高壓滅菌鍋、鑷子原料與藥品:梔子、谷氨酸、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、***化鈉培育基:分別篩選培育基:牛肉膏蛋白胨培育基鑒定培育基:牛肉膏蛋白胨培育基+梔子+谷氨酸試驗(yàn)方法:β-葡萄糖苷酶的菌株篩選富集培育〔初篩〕〔牛肉膏蛋白胨培育基〕:試驗(yàn)預(yù)備:收集產(chǎn)酶菌株可能存在的樣品:中藥港采集穎土樣、梔子在土里培育發(fā)霉的土樣儀器滅菌:將培育皿、移液管、涂布棒、移液槍頭、蒸餾水等滅菌煮梔子浸提液:稱量已粉碎梔子,加適量水煮一個(gè)小時(shí),紗布過(guò)濾收集濾液,重復(fù)煮三到四次煮,將幾次煮的濾液混合,濾液收集體積與梔子稱量的量為10:1。

配制牛肉膏蛋白胨培育基按培育基配方稱好,瓊脂,加熱溶化,分裝,121攝氏度高壓滅菌20,倒平板。

用梯度稀釋法來(lái)分別產(chǎn)生菌:取所采的土樣5,參與到裝有45無(wú)菌水的三角瓶中,振蕩5,制成土壤懸液,此時(shí)的稀釋度為10-1。

另取7支試離心管,分別記作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8個(gè)梯度,每支離心管內(nèi)參與9無(wú)菌水。

用無(wú)菌移液管從三角瓶中吸取1土壤懸液,參與到10-2離心管中混勻,再?gòu)慕裨嚬苤形?參與到10-2離心管中,依此類(lèi)推直至10-7離心管。

分別從10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8七個(gè)稀釋度的離心管中吸取100懸液,勻稱涂布于分別培育基平板上,于30℃培育。

24后觀看現(xiàn)象。

復(fù)篩、鑒定培育基復(fù)篩稱取谷氨酸〔培育基的1%,在超凈工作臺(tái)滅菌20〕參與到牛肉膏蛋白胨培育基中充分溶解,吸取梔子浸提液〔培育基的10%〕到培育基中搖勻,倒平板。

將上述富集培育的菌種涂布或劃線或點(diǎn)種到鑒定培育基上,培育24后觀看變色圈。

、分別純化將有透亮圈的菌株挑出分別純化試驗(yàn)二、菌種的保藏和活化一、目的和要求1、了解各種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用的目標(biāo)微生物。

2、并把握幾種常用的微生物菌種保藏方二、試驗(yàn)原理保藏微生物菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身,而且還必需要盡可能地使菌株的遺傳性狀保持不變,同時(shí)保證其在整個(gè)保存過(guò)程中不被他種微生物污染。

因此,選擇一種能夠長(zhǎng)期有效且穩(wěn)定的保藏微生物菌種的方法事關(guān)重要。

使微生物的代謝作用降至最低程度,從而使其處于不活潑的狀態(tài),即休眠狀態(tài)。

就微生物本身而言,保藏就是要利用它們處于休眠狀態(tài)的孢子或芽孢而進(jìn)展;而從環(huán)境條件來(lái)說(shuō),就是要選用低溫、枯燥和缺氧等三個(gè)條。

三、試驗(yàn)材料純化好的目的菌種、40﹪甘油、管四、試驗(yàn)步驟1、甘油管制備:用量筒精確?????量取40試劑級(jí)丙三醇,再加蒸餾水60,搖勻,即為40%甘油溶液。

將配置好的甘油溶液放于25的三角瓶中塞好棉塞,用紗布,牛皮紙包扎好,再把1-5的凍存管用紗布牛皮紙包扎好,,1202℃濕熱滅菌1-,間歇滅菌3-5次,滅菌后置34℃恒溫室培育24-48小時(shí),經(jīng)抽樣5%做無(wú)菌試驗(yàn),確定無(wú)菌方可使用。

2、菌種保藏:取第三代純化的菌種平板,用無(wú)菌水將目的菌洗下,用移液槍將其移入帶有玻璃珠的三角瓶中振蕩15,將其傾入漏斗三角瓶上過(guò)濾,目的菌和40﹪甘油以1:1的比例放入管中,放入-20℃冰箱中保藏。

五、菌種復(fù)活從冰箱中取出管進(jìn)展解凍,解凍后在超凈工作臺(tái)中將保藏菌種接種于倒好培育基的平板中,首先每個(gè)管中取100菌液接種于平板中,每個(gè)管接一個(gè)平板,然后將接種好的平板于30℃的培育箱中進(jìn)展培育,最終觀看菌種的生長(zhǎng)狀況。

試驗(yàn)三β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的誘變一、菌懸液的制備無(wú)菌狀態(tài)下,%無(wú)菌生理鹽水移入牛肉膏蛋白胨培育基斜面菌種中洗脫菌種,然后經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾取濾液,倒入預(yù)先滅菌的具有玻璃珠、磁力棒和90生理鹽水的錐形瓶中,于磁力攪拌器上攪拌10,使菌種完全分散,制成不同菌濃度的菌懸濁液,備用。

二、紫外誘變選育高產(chǎn)菌株承受功率為15,照射距離為20,分別對(duì)一樣濃度和體積的菌懸液進(jìn)展輻射處理,照射時(shí)間分別為40、80、120、160、200、240、280、320、360、400、440、480,將處理過(guò)的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培育基上,培育后計(jì)算致死率。

以致死率在80%~90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培育基〔改進(jìn)牛肉膏蛋白胨培育基,含10%梔子液及谷氨酸〕上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。

致死率=比照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)比照菌落數(shù)100%。

三、超聲波誘變選育高產(chǎn)菌株承受20、200的超聲波條件,分別對(duì)一樣濃度和體積的菌懸液進(jìn)展輻射處理10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120,將處理過(guò)的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培育基上,培育后計(jì)算致死率。

以致死率在80%~90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培育基上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。

四、微波誘變選育高產(chǎn)菌株承受脈沖頻率為2450,功率為800的微波爐,分別對(duì)一樣濃度和體積的單孢子懸液進(jìn)行輻射處理。

每次照射30后使平皿冷卻,再進(jìn)展照射,并將照射時(shí)間累計(jì)。

設(shè)定不同的輻射時(shí)間為不同的微波處理劑量,一樣條件非輻射菌懸液平板培育,計(jì)算致死率:致死率=〔比照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)〕比照菌落數(shù)100%依據(jù)致死率,以致死率超過(guò)90%的誘變劑量處理菌懸液,輻射后涂布涂布于篩選平板培育基上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。

留意:1、誘變的同時(shí)要做比照,即不照射紫外或其他射線,在同等條件下培育。

2、紫外誘變要在沒(méi)有照看的狀況下進(jìn)展,誘變后的培育也在黑暗的狀況下培育〔可用黑色塑料袋包好后,置于培育箱培育〕。

試驗(yàn)四、發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)?zāi)康?把握微生物斜面培育基、種子培育基及發(fā)酵培育基確定方法,學(xué)會(huì)對(duì)已確定菌種確定試驗(yàn)室發(fā)酵工藝。

一培育基成分1、斜面培育基:牛肉膏蛋白胨固體培育基2、種子培育基:牛肉膏蛋白胨固體培育基液體培育基3、發(fā)酵培育基牛肉膏蛋白胨固體培育基液體培育基二試驗(yàn)方法1、菌種的復(fù)活:將菌種在無(wú)菌條件下接入斜面培育基中,30℃、種子培育:將斜面菌株接種到種子培育基中,30℃:將培育后的種子培育基中的菌體按10%接種量接人到發(fā)酵培育基250三角瓶裝25培育液,121℃滅菌20分鐘,30℃,搖床180轉(zhuǎn)分,培小72時(shí),取動(dòng)身酵液,4000離心10分鐘,收集上清液,測(cè)轉(zhuǎn)化率。

5液體發(fā)酵培育基的優(yōu)化不同碳源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響:分別以麩皮,玉米粉,蔗糖,淀粉,麥芽糖為碳源,發(fā)酵培育,測(cè)酶活,選著最正確碳源,:分別以硫酸銨,蛋白胨,酵母膏,***鈉,尿素為氮源,發(fā)酵培育,測(cè)酶活,選著最正確氮源,:分別在發(fā)酵培育基中參與0,%、%,%,%,%,%的磷酸鉀進(jìn)展優(yōu)化發(fā)酵起始優(yōu)化;將起始分別調(diào)至4,5,6,7,8進(jìn)展發(fā)酵,選著最適值。

:發(fā)酵溫度分別把握在26℃,28℃,30℃,32℃,34℃下培育,選著最適發(fā)酵培育溫度。

搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化;在最適溫度下,分別以140,160,180,200,220下發(fā)酵培育,選著最正確轉(zhuǎn)速。

接種量的優(yōu)化:接種量分別為5%,10%,15%,發(fā)酵培育,:分別培育3,4,5,6,7,8,9天,測(cè)轉(zhuǎn)化率,:分別裝25,40,55,70,85,100培育基,進(jìn)展發(fā)酵培育,、試劑配制:一精氨酸〔〕:稱取20毫克精氨酸溶解后定溶于100容量瓶,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二、操作步驟;1、用無(wú)菌水沖洗斜面孢子,并用接種環(huán)不斷刮斜面以使孢子懸浮充分。

將其接種到加有確定量梔子浸提液〔如:終濃度2%、5%〕的發(fā)酵培育基中,30℃,150震蕩培育3。

同時(shí)以不接種的梔子浸提液發(fā)酵培育基,30℃,150震蕩培育3做為空白比照〔留意:假設(shè)做不同梔子量的培育基水尋常,要記得有針對(duì)的空白比照。

如2%和5%有各自對(duì)應(yīng)的空白比照。

〕。

2、取動(dòng)身酵液,40000高速離心10分鐘,收集上清液即為京尼平樣品溶液。

3、,,用蒸