目的基因的表達(dá)與調(diào)控目的基因的表達(dá)與調(diào)控1基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)的目的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物?；蚬こ碳夹g(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)?；虮磉_(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個(gè)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有的加工過程就是基因表達(dá)的過程，它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用下完成的。基因重組的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，2基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進(jìn)行，生成hnRNA，核內(nèi)加工：剪接內(nèi)含子和外顯子，修飾5’和3’末端后形成成熟mRNA。而后在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級(jí)結(jié)構(gòu)。目前已構(gòu)建出多種基因表達(dá)系統(tǒng)，包括原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。原核生物基因表達(dá)以操縱子的形式進(jìn)行;

操縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用，結(jié)構(gòu)基因開始轉(zhuǎn)錄成mRNA，同時(shí)，mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯近乎同時(shí)完成，mRNA隨之被水解掉。基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，3本章主要內(nèi)容8.1基因表達(dá)的機(jī)制8.2基因表達(dá)的調(diào)控元件8.3外源基因表達(dá)系統(tǒng)

8.3.1大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)（重點(diǎn)）

8.3.2芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）

8.3.3鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）

8.3.4藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)（了解）

8.3.5酵母表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）

8.3.6哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）

8.3.7植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）8.4基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化8.5基因工程的爭(zhēng)論和安全措施本章主要內(nèi)容8.1基因表達(dá)的機(jī)制48.1基因表達(dá)的機(jī)制8.1.1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的關(guān)鍵（限速）環(huán)節(jié)。選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子（例如，可調(diào)控的啟動(dòng)子）和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)高效表達(dá)系統(tǒng)的首要問題。原核生物啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：組成型啟動(dòng)子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的啟動(dòng)子如T7噬菌體的啟動(dòng)子真核生物啟動(dòng)子較復(fù)雜，可分為：誘導(dǎo)型、組成型和特異性啟動(dòng)子等類型8.1基因表達(dá)的機(jī)制8.1.1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因58.1.2mRNA的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。涉及兩個(gè)問題：1、要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘發(fā)的mRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止；2、要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。8.1.2mRNA的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持m68.1.3外源基因mRNA的有效翻譯外源基因mRNA有效翻譯必須考慮的基本原則：AUG(ATG)是首選的起始密碼子。SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3～9個(gè)堿基。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。8.1.3外源基因mRNA的有效翻譯外源基因mRNA有效7不同基因組使用密碼子具有選擇性。主密碼子（majorcodon）罕用密碼子（rarecodon）如果外源基因mRNA的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則基因表達(dá)效率就高；否則，其表達(dá)效率就低。不同基因組使用密碼子具有選擇性。主密碼子（majorcod88.1.4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對(duì)策：構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)8.1.4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性避免外源基因表達(dá)蛋白降98.1.5目的基因沉默基因沉默的作用機(jī)制基因在基因組中的位置對(duì)其表達(dá)的影響DNA水平上的基因調(diào)控RNA水平上的基因調(diào)控位置效應(yīng)的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：8.1.5目的基因沉默基因沉默的作用機(jī)制基因在基因組中的108.2基因表達(dá)的調(diào)控元件8.2.1啟動(dòng)子啟動(dòng)子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶通過與它的結(jié)合而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。原核基因啟動(dòng)子具有－10和－35序列等結(jié)構(gòu)元件，而真核基因啟動(dòng)子則具有TATA盒及上游元件等特征結(jié)構(gòu)。序列特異性方向性位置特性種屬特異性啟動(dòng)子的特征8.2基因表達(dá)的調(diào)控元件8.2.1啟動(dòng)子啟動(dòng)子（pr118.2.1.1原核生物的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：多數(shù)細(xì)菌啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列為CAT，轉(zhuǎn)錄從第二個(gè)堿基起始，該堿基為嘌呤堿基（A/G）。Pribnow框：－10bp處的TATA區(qū)（－10序列區(qū)）Sextama框：－35bp處的TTGACA區(qū)（－35區(qū)）間隔區(qū)：內(nèi)部無明顯的保守性，其序列長度比堿基組成對(duì)啟動(dòng)子的功能更重要。8.2.1.1原核生物的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：多數(shù)細(xì)菌啟動(dòng)12原核生物啟動(dòng)子序列特征示意圖

（Theprokaryoticpromoter）

RNA聚合酶結(jié)合和起始轉(zhuǎn)錄的序列（ThesequenceofDNAneededforRNApolymerasetobindtothetemplateandaccomplishtheinitiationreaction）TTGACATATAATTranscriptionalstartsite5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45CAT原核生物啟動(dòng)子序列特征示意圖

（Theprokaryot138.2.1.1真核生物的啟動(dòng)子Ⅰ型：rRNA基因啟動(dòng)子Ⅱ型：mRNA

基因啟動(dòng)子Ⅲ型：tRNA

基因啟動(dòng)子8.2.1.1真核生物的啟動(dòng)子Ⅰ型：rRNA基因啟動(dòng)子14Ⅰ型啟動(dòng)子所屬基因編碼的產(chǎn)物為rRNA前體，經(jīng)剪切加工后成為各種成熟的rRNA分子。人體細(xì)胞Ⅰ型啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子：緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。上游控制元件（UCE）：位于起始位點(diǎn)上游－180～－190bp處，它可以大幅度增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率Ⅰ型啟動(dòng)子所屬基因編碼的產(chǎn)物為rRNA前體，經(jīng)剪切加工后成為15Ⅱ型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列區(qū)，它與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇。其中心點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－20～－30bp的位置CAAT框：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－75bp處，與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。GC框：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－100～－300bp處，與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合有關(guān)。啟動(dòng)子基本區(qū)輔助區(qū)Ⅱ型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TATA框（Hogness框）：富含A16Ⅲ型啟動(dòng)子內(nèi)啟動(dòng)子：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，如tRNA和5SRNA的啟動(dòng)子。外啟動(dòng)子：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，缺乏相應(yīng)的內(nèi)部序列。例如：脊椎動(dòng)物U6核小RNA和7SKRNA啟動(dòng)子，結(jié)構(gòu)類似于真核生物Ⅱ型啟動(dòng)子。Ⅲ型啟動(dòng)子內(nèi)啟動(dòng)子：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，如tRNA和178.2.1.3啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)大腸桿菌RNA聚合酶的亞基成分

RNA聚合酶：核心酶(α2ββ’)＋σ亞基＝全酶(α2ββ’σ)8.2.1.3啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)大腸桿菌RNA聚合酶的亞基18第8講目的基因的表達(dá)與調(diào)控ppt課件19σ

factor:σfactor:208.2.1.4啟動(dòng)子的分離隨機(jī)克隆法PCR擴(kuò)增法待分離啟動(dòng)子的DNA分子酶切后，連接到含有缺啟動(dòng)子的報(bào)告基因的載體上，挑選陽性克隆子后進(jìn)一步分析獲得的含有啟動(dòng)子的片段。聚合酶保護(hù)法過濾膜結(jié)合法根據(jù)RNA聚合酶與啟動(dòng)子特異性結(jié)合的原理，取基因組文庫中的重組質(zhì)粒與RNA聚合酶在體外溫浴一段時(shí)間，讓RNA聚合酶與特異啟動(dòng)子序列結(jié)合。而后選擇合適的限制性內(nèi)切酶或外切酶消化重組質(zhì)粒，以未加RNA聚合酶的DNA作對(duì)照。瓊脂糖電泳分析酶切消化產(chǎn)物，被鈍化的酶切位點(diǎn)或片段位于RNA酶保護(hù)區(qū)域內(nèi)，即RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)可能含有啟動(dòng)子序列。進(jìn)一步將該片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒上，分析和檢測(cè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。8.2.1.4啟動(dòng)子的分離隨機(jī)克隆法PCR擴(kuò)增法待分離218.2.2增強(qiáng)子增強(qiáng)子（enhancer）：是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列，又稱強(qiáng)化子。增強(qiáng)子的特性：雙向性。重復(fù)序列。增強(qiáng)子行使功能與所處的位置無關(guān)。特異性。增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時(shí)有調(diào)控功能，與異源基因相連時(shí)也有功能。8.2.2增強(qiáng)子增強(qiáng)子（enhancer）：是能夠增強(qiáng)啟228.2.3終止子本征終止子：不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。依賴終止信號(hào)的終止子：要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子。8.2.3終止子本征終止子：不需要其他蛋白輔助因子便可在23①本征終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)(莖環(huán)結(jié)構(gòu))：延緩RNA聚合酶的運(yùn)動(dòng)，不終止RNA的合成，但為轉(zhuǎn)錄終止創(chuàng)造條件。寡聚U組成的尾部：轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。兩大特征特征①本征終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)(莖環(huán)結(jié)構(gòu))：延緩RNA聚合酶的運(yùn)動(dòng)，不24②依賴型終止子終止位點(diǎn)上游50～90bp區(qū)域，是ρ因子的識(shí)別位點(diǎn)。ρ因子依賴型終止子也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但莖環(huán)的GC含量較低，因此RNA聚合酶在此移動(dòng)的速度減慢，但停留時(shí)間較短，并且莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游沒有寡聚U結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶只能在ρ因子的協(xié)助下才能有效終止轉(zhuǎn)錄。ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子量為2.0×105的六聚體蛋白質(zhì)分子，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。由于它催化NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。②依賴型終止子終止位點(diǎn)上游50～90bp區(qū)域，是ρ因子的識(shí)別25在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著5’ -3’方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3’－OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠AT268.2.4衰減子衰減子（attenuator）：是位于mRNA分子前導(dǎo)序列中的一段控制蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)節(jié)區(qū)，亦即發(fā)生弱化作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，又稱弱化子。衰減子最先發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌色氨酸（trp）操縱子中。8.2.4衰減子衰減子（attenuator）：是位于m27trp前導(dǎo)區(qū)的4個(gè)片段（1、2、3、4）能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)，有時(shí)以1-2和3-4配對(duì)，有時(shí)只以2-3配對(duì)。在前導(dǎo)肽基因中有兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，所以前導(dǎo)肽的翻譯對(duì)tRNATrp的濃度很敏感。當(dāng)培養(yǎng)基中trp濃度很低時(shí)，負(fù)載有trp的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個(gè)相鄰trp密碼子的速度就很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個(gè)相鄰的trp密碼子處），這時(shí)前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是2-3配對(duì)，不形成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到trp操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)trp濃度高時(shí)，核糖體可順利通過兩個(gè)相鄰的trp密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使2-3不能配對(duì)，3-4區(qū)可自由配對(duì)形成莖－環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄。所以，弱化子對(duì)RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。大腸桿菌色氨酸（trp）操縱子中衰減子的作用trp前導(dǎo)區(qū)的4個(gè)片段（1、2、3、4）能以兩種不同的方式進(jìn)28第8講目的基因的表達(dá)與調(diào)控ppt課件29第8講目的基因的表達(dá)與調(diào)控ppt課件308.2.5絕緣子絕緣子（insulator）：既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件；它能阻止鄰近的調(diào)控元件對(duì)其所界定基因的啟動(dòng)子起增強(qiáng)或抑制作用；絕緣子抑制增強(qiáng)子的功能是有極性的。它只能抑制處于絕緣子所在邊界另一側(cè)的增強(qiáng)子的作用，而對(duì)處于同一結(jié)構(gòu)域的增強(qiáng)子沒有抑制作用；絕緣子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，它是通過細(xì)胞內(nèi)特定的蛋白質(zhì)因子相互作用而產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)的。8.2.5絕緣子絕緣子（insulator）：318.2.6反義子反義RNA（antisenceRNA）：同某種天然mRNA反向互補(bǔ)的RNA分子稱為反義RNA，它是由雙鏈DNA中的無意義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，可以用來阻止被其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的與之互補(bǔ)mRNA的轉(zhuǎn)譯活性。（antisencetechology）。反義子：編碼反義RNA的DNA稱為反義子。反義子在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。8.2.6反義子反義RNA（antisenceRNA）32

復(fù)制水平的調(diào)節(jié)直接抑制——反義RNA與引物RNA前體互補(bǔ)，使得引物RNA無法與DNA模板結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制的頻率。間接抑制——反義RNA通過阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成而間接抑制DNA的復(fù)制。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)反義RNA通過與mRNA的5′端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；作用于mRNA的poly(A)區(qū)域，抑制mRNA的成熟及其運(yùn)輸；與真核生物mRNA結(jié)合而影響其剪切加工。復(fù)制水平的調(diào)節(jié)直接抑制——反義RNA與引物RNA前體互補(bǔ)，33

翻譯水平的調(diào)節(jié)通過與mRNA的5′端SD序列結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而影響核糖體在mRNA上的定位；通過與mRNA的5′端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑制翻譯的起始。SD序列（SDsequence）：Shine-Dalgarno序列的簡(jiǎn)稱，此為紀(jì)念最早發(fā)現(xiàn)該序列的研究者而命名的。它是原核生物中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，亦即存在于mRNA分子AUG起始密碼子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可與16SrRNA的3′-末端序列互補(bǔ)。SD序列在核糖體同mRNA的結(jié)合過程中起重要作用。翻譯水平的調(diào)節(jié)通過與mRNA的5′端SD序列結(jié)合，改變其348.3外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體受體細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。8.3外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表35原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞的特點(diǎn)原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)相。內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞的特點(diǎn)原核生物大多數(shù)為單細(xì)368.3.1大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，是目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng)。8.3.1大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)37與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性：①經(jīng)過長期研究，人們已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的背景知識(shí)，特別是對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有了深刻的了解；②大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；③實(shí)驗(yàn)證明：許多真核基因，例如抑制生長素基因和胰島素基因等都能在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；④培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易于工業(yè)化批量生產(chǎn)與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性：①經(jīng)過長388.3.1.1大腸桿菌基因表達(dá)載體8.3.1.1大腸桿菌基因表達(dá)載體39大腸桿菌基因表達(dá)載體

可分為3個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)大腸桿菌基因表達(dá)載體

可分為3個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的40（1）DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制子：是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。大腸桿菌基因表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體，含有能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。注意：同一大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，含同一類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體不能共存，但含不同類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體則可以共存常見的復(fù)制子pMB1、p15A、ColE1：松弛復(fù)制型，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)10～20個(gè)。pSC101:嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)少于5個(gè)。（1）DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制子：是一段包含復(fù)制起41選擇標(biāo)記目的：使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌群中分離出來。在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記記號(hào)，包括有新陳代謝特性、對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。而絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號(hào)，并且主要集中在氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、鏈霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少數(shù)幾種抗菌素抗性記號(hào)上。原因：1）由于許多質(zhì)粒本身就是帶有抗菌素抗性基因的抗藥性R因子；2）抗菌素抗性記號(hào)具有便于操作、易于選擇等優(yōu)點(diǎn)。選擇標(biāo)記目的：使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌42第8講目的基因的表達(dá)與調(diào)控ppt課件43（2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)這一系統(tǒng)包括啟動(dòng)子、抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子和終止子因宿主的不同而有差別，往往在不同的宿主中表達(dá)的效率也不一樣，特別是原核生物和真核生物宿主間完全不同，相互間不能通用。啟動(dòng)子啟動(dòng)子（promotor）：是一段能被宿主RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。外源目的基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。（2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)這一系統(tǒng)包括啟動(dòng)子、抑制物基因和44啟動(dòng)子的特征啟動(dòng)子位于基因的上游，其序列的長度因生物的種類而異。當(dāng)RNA聚合酶定位并結(jié)合到啟動(dòng)子序列上時(shí)，便可啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子具有序列特異性、啟動(dòng)的方向性、作用位點(diǎn)的特異性和種屬特異性等特征。在大腸桿菌細(xì)胞中大多數(shù)基因的啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離為6～9bp，但對(duì)于要表達(dá)的外源基因來說，啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最佳距離還有待實(shí)驗(yàn)來確定。啟動(dòng)子的特征啟動(dòng)子位于基因的上游，其序列的長度因生物的種類而45抑制物基因抑制物基因的產(chǎn)物是一種控制啟動(dòng)子功能的蛋白質(zhì)，對(duì)啟動(dòng)子的起始轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生抑制作用。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可使抑制物失活，啟動(dòng)子功能重新恢復(fù)。理想的可調(diào)控的啟動(dòng)子在細(xì)胞生長的初期往往不表達(dá)或低水平表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞增殖到一定的密度后，在某種特定的誘導(dǎo)因子（如光、溫度或化學(xué)藥物等）的誘導(dǎo)下，RNA聚合酶才開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，合成mRNA。抑制物基因抑制物基因的產(chǎn)物是一種控制啟動(dòng)子功能的蛋白質(zhì)，對(duì)啟46轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）：是一段終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止子可分為本征終止子和依賴終止信號(hào)的終止子兩類。轉(zhuǎn)錄終止子的作用：

1、它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)RNA的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量；

2、正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在能夠防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因mRNA的長度，提高mRNA的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)。轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）：是一段終止RN47（3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)在原核生物中影響翻譯起始的因素有：起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）、起始密碼子于SD序列之間的距離和堿基組成、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、mRNA上游的5′端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的5′端序列等。蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）翻譯起始密碼子翻譯終止密碼子（3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)在原核生物中影響翻譯起始的因素有：起始488.3.1.2宿主菌重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因：大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)；大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定因子；大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度的微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株8.3.1.2宿主菌重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因498.3.1.3常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)：是以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)：是以λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL和PR構(gòu)建的。T7表達(dá)系統(tǒng)：是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。8.3.1.3常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和Tac表達(dá)系508.3.1.4外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式表達(dá)形式：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩種。包涵體蛋白包涵體：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。包涵體存在部位：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)8.3.1.4外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式表達(dá)形式：不溶51包涵體的組成蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物：占大部分，具有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象錯(cuò)誤，因而包涵體蛋白一般沒有生物學(xué)活性。受體細(xì)胞本身的表達(dá)產(chǎn)物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵體形成的本質(zhì)——是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集，主要包括三個(gè)方面：①折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；②非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；③蛋白質(zhì)折疊中間體的作用。包涵體的組成蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物：占大部分，具有52融合蛋白①穩(wěn)定性好；②表達(dá)效率高；③較易于分離純化。融合蛋白——將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個(gè)基因的閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白稱為融合蛋白。融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)：（與單獨(dú)表達(dá)的外源蛋白相比）融合蛋白①穩(wěn)定性好；融合蛋白——將外源蛋白基因與受體菌自身蛋53寡聚型外源蛋白在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋白稱為寡聚型外源蛋白。外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：1、多表達(dá)單元的重組：3、多編碼序列重組：2、多順反子重組：寡聚型外源蛋白在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源目的蛋白基54整合型外源蛋白將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為整合型外源蛋白。整合型外源蛋白將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)上55分泌型外源蛋白外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過運(yùn)輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中，即為分泌型外源蛋白。分泌型外源蛋白外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過運(yùn)輸或分泌的方式穿過細(xì)56優(yōu)點(diǎn)：（分泌型蛋白的形式表達(dá)外源基因）①分泌型可能使蛋白質(zhì)按適當(dāng)?shù)姆绞秸郫B，有利于形成正確的空間構(gòu)相，獲得有較好生物學(xué)活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。甚至有些在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無活性的蛋白質(zhì)分泌后則有活性。②分泌到細(xì)胞外周質(zhì)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解。③簡(jiǎn)化了發(fā)酵后處理的純化工藝。缺點(diǎn)：外源蛋白分泌型表達(dá)通常產(chǎn)量不高，有時(shí)信號(hào)肽不被切割或在不適當(dāng)?shù)奈恢冒l(fā)生切割。優(yōu)點(diǎn)：（分泌型蛋白的形式表達(dá)外源基因）①分泌型可能使蛋白質(zhì)按578.3.1.5在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略高效表達(dá)外源基因須考慮的基本原則：1）優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。2）提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用。3）提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性。4）提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。5）優(yōu)化發(fā)酵過程。8.3.1.5在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略高效表達(dá)588.3.2芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）芽孢桿菌——屬革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外。目前常用作基因表達(dá)系統(tǒng)的有枯草桿菌和短小芽孢桿菌等。利用芽孢桿菌作為表達(dá)外源基因的受體菌的優(yōu)點(diǎn)：芽孢桿菌多是非致病性微生物，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長迅速；表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物學(xué)活性；某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作；利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。8.3.2芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）芽孢桿菌——屬革蘭氏陽598.3.3鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素；可進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)；可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級(jí)代謝途徑和初、次級(jí)代謝調(diào)控體系，表達(dá)外源蛋白的時(shí)間較長；鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)。

鏈霉菌—革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。鏈霉菌作為外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn)：8.3.3鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)（了解）為非致病性細(xì)菌，不產(chǎn)生內(nèi)608.3.4藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)（了解）藍(lán)藻——又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌的特征，無細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍(lán)藻與真核生物藻類最大的區(qū)別是：它無葉綠體，無真核，有70S核糖體，細(xì)胞壁中含有肽聚糖，因而對(duì)青霉素和溶菌酶十分敏感等。8.3.4藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)（了解）藍(lán)藻——又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌61藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)。628.3.5酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌的特點(diǎn)：基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制比較清楚，遺傳操作相對(duì)簡(jiǎn)便，并于1996年完成了對(duì)釀酒酵母基因組全序列的測(cè)定；具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾系統(tǒng)；可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；對(duì)人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒；可進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡(jiǎn)單而成熟，成本低廉。8.3.5酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖638.3.5.1酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復(fù)制子等）和宿主染色體DNA上自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制。8.3.5.1酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由酵母648.3.5.2酵母基因表達(dá)載體的種類自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，YRP）整合型質(zhì)粒載體（yeastintegrationplasmid，YIP）含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和基因克隆位點(diǎn)等元件，能夠在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效率較高，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)可達(dá)200個(gè)，但經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細(xì)胞中的拷貝數(shù)會(huì)迅速減少。不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進(jìn)行自主復(fù)制，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，并隨染色體一起進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒與染色體DNA的同源重組主要有單交換整合和雙交換整合兩種方式。8.3.5.2酵母基因表達(dá)載體的種類自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（65著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromericplasmid，YCP）在自主復(fù)制型質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細(xì)胞分裂時(shí)，質(zhì)粒載體能平均分配到子細(xì)胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個(gè)拷貝。著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromericpla66酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）在細(xì)胞分裂和遺傳過程中，能將載體均勻分配到子細(xì)胞中，并保持相對(duì)獨(dú)立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標(biāo)記基因SUP4表達(dá)時(shí)轉(zhuǎn)化子菌落呈白色，不表達(dá)時(shí)呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～1000kb的外源基因片段，特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達(dá)研究。在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)單拷貝，包含酵母染色體自主復(fù)制序列、著絲粒序列、端粒序列、酵母菌選擇標(biāo)記基因、大腸桿菌復(fù)制子和選擇標(biāo)記基因等。酵母人工染色體（yeastartificialchrom678.3.5.3酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要宿主菌釀酒酵母*巴斯德畢赤酵母乳酸克努維酵母多型漢森酵母8.3.5.3酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要宿688.3.6哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體：質(zhì)粒載體和病毒載體哺乳動(dòng)物基因表達(dá)質(zhì)粒載體是一類穿梭質(zhì)粒，能夠在細(xì)菌（大腸桿菌）和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是最高等的真核生物細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)調(diào)控更加復(fù)雜。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)加工等過程。要表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)和具有特異性催化功能的酶，需要在高等真核生物細(xì)胞中進(jìn)行。8.3.6哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)（自學(xué)）哺乳動(dòng)物基因表698.3.7植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)*時(shí)空特異性

植物細(xì)胞基因表達(dá)與調(diào)控的特點(diǎn)8.3.7植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)*時(shí)空特異性植物細(xì)胞基因708.4基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化8.4.1

基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)的過程就是對(duì)特異性mRNA或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。檢測(cè)特異性mRNA的方法Northern雜交法檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的方法生化反應(yīng)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法生物學(xué)活性檢測(cè)法目的基因表達(dá)產(chǎn)物沒有可供直接檢測(cè)的性質(zhì)時(shí)，可將外源基因與標(biāo)記基因或報(bào)告基因一起構(gòu)成嵌合基因，通過檢測(cè)嵌合基因中的標(biāo)記基因或報(bào)告基因間接確定外源目的基因的存在和表達(dá)。8.4基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化8.4.1基因表達(dá)產(chǎn)物718.4.1.1外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)Southern雜交可以檢測(cè)到外源基因是否存在于受體細(xì)胞中，但不能確定外源基因是否轉(zhuǎn)錄。Northern雜交技術(shù)可以檢測(cè)外源基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。提取總RNA分離mRNA。制備RNA探針。Northern雜交。檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可采用RT-PCR的方法。8.4.1.1外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)Southern雜交728.4.1.2報(bào)告基因的酶法檢測(cè)報(bào)告基因必須具備兩大特點(diǎn)：其表達(dá)產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中不存在；其表達(dá)產(chǎn)物便于檢測(cè)。目前植物基因工程中使用的報(bào)告基因一般是編碼酶的基因，主要有β-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat基因）、冠癭堿合成酶基因（胭脂堿合成酶基因、章魚堿合成酶基因）、抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。8.4.1.2報(bào)告基因的酶法檢測(cè)報(bào)告基因必須具備兩大特點(diǎn)73cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶催化?；梢阴oA轉(zhuǎn)向氯霉素，而乙?；穆让顾夭辉倬哂新让顾氐幕钚?，失去了干擾蛋白質(zhì)合成的作用。真核細(xì)胞不含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，無該酶的內(nèi)源性活性，因而cat基因可作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因及報(bào)告基因。cat基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞能夠產(chǎn)生對(duì)氯霉素的抗性，并可通過對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)來了解外源基因的表達(dá)。cat的活性可以通過反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或反應(yīng)產(chǎn)物乙酰化氯霉素及還原型CoASH的生成來測(cè)定，目前常用的方法有硅膠G薄層層析法及DTNB分光光度法。cat（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）基因的檢測(cè)氯霉素最早是從放線菌屬委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中分離出來的，現(xiàn)在使用的是化學(xué)合成品。氯霉素能選擇地與原核細(xì)胞50S亞基或真核細(xì)胞線粒體核糖體大亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成。cat基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶催化?；梢阴oA轉(zhuǎn)向74gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因的檢測(cè)gus基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，編碼β-葡萄糖苷酸酶，該酶是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)的植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的gus活性，許多細(xì)菌及真菌也缺乏內(nèi)源gus活性，因而gus基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)菌和真菌的報(bào)告基因，尤其在基因外源基因瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，gus基因應(yīng)用得最多。常用于gus基因檢測(cè)的底物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）組織化學(xué)染色定位法4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）熒光測(cè)定法對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）分光光度測(cè)定法gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因的檢測(cè)gus基因存在于某些細(xì)75熒光素酶基因的檢測(cè)用作報(bào)告基因的熒光素酶主要來自細(xì)菌或螢火蟲。螢火蟲熒光素酶催化的底物是6-羥基喹啉類，在Mg2+、ATP及O2作用下，酶使底物氧化脫羧，生成激活態(tài)的氧化熒光素，其發(fā)射光子后轉(zhuǎn)變成常態(tài)的氧化熒光素，反應(yīng)中化學(xué)能轉(zhuǎn)變成光能。熒光素＋ATP+O2氧化熒光素＋CO2+AMP+PPi+光螢火蟲熒光素酶細(xì)菌熒光素酶以脂肪醛為底物，需要還原型的黃素單核苷酸及氧參與，使脂肪醛氧化為脂肪酸，同時(shí)放出光子。RCHO+O2+FMNH2RCOOH+H2O+FMN+光細(xì)菌熒光素酶檢測(cè)方法有兩種：活體內(nèi)熒光素酶活性檢測(cè)體外熒光素酶活性檢測(cè)綠色熒光蛋白GFP自身發(fā)光，不需底物。熒光素酶Luciferase需要熒光素底物，當(dāng)實(shí)驗(yàn)中可以加入足夠的熒光素底物的時(shí)候，因?yàn)槊傅姆糯笮?yīng)，熒光素酶更靈敏。熒光素酶基因的檢測(cè)用作報(bào)告基因的熒光素酶主要來自細(xì)菌或螢火蟲76dhfr（二氫葉酸還原酶）基因的檢測(cè)dhfr基因又稱氨甲蝶呤抗性基因，編碼二氫葉酸還原酶。該酶能催化二氫葉酸還原為四氫葉酸，而四氫葉酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤與二氫葉酸結(jié)構(gòu)類似，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶的活性。植物細(xì)胞的二氫葉酸還原酶對(duì)氨甲蝶呤極為敏感，而來自于細(xì)菌或小鼠的二氫葉酸還原酶對(duì)氨甲蝶呤的敏感性很低。用細(xì)菌的二氫葉酸還原酶作為報(bào)告基因，可使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞在一定濃度的氨甲蝶呤培養(yǎng)基中正常生長，而非轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞則不能生長。dhfr（二氫葉酸還原酶）基因的檢測(cè)dhfr基因又稱氨甲蝶呤778.4.1.3免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)免疫沉淀法酶聯(lián)免疫吸附法Western沉淀法固相放射免疫法

免疫沉淀法可應(yīng)用于表達(dá)產(chǎn)物的定性與定量分析。優(yōu)點(diǎn)：選擇性好，靈敏度高，可檢測(cè)出100pg水平的放射性標(biāo)記蛋白，并可從蛋白質(zhì)混合物中提純出抗原－抗體復(fù)合物。8.4.1.3免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)免疫沉淀法酶聯(lián)免疫吸附78免疫沉淀法的步驟：①對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。②細(xì)胞裂解。③形成特異性免疫復(fù)合物。④靶蛋白的免疫沉淀。⑤蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。免疫沉淀法的步驟：①對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記。79

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）ELISA是一種利用免疫學(xué)原理檢測(cè)抗原、抗體的技術(shù)。它與經(jīng)典的以同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的液－液抗原－抗體反應(yīng)體系不同之處是建立了固－液抗原－抗體反應(yīng)體系，并采用酶標(biāo)記?？贵w與抗原的結(jié)合通過酶反應(yīng)來檢測(cè)。由于酶反應(yīng)的放大作用，使測(cè)定的靈敏度極高，可檢出1pg的目的物。同時(shí)酶反應(yīng)還具有很強(qiáng)的特異性。因此ELISA是基因表達(dá)研究中不可缺少的方法。除了可溶性抗原（抗體）之外，ELISA還可以檢測(cè)含表面抗原的細(xì)胞。ELISA檢測(cè)外源基因表達(dá)蛋白的四個(gè)步驟：①抗體制備②抗體或抗原的包被③免疫反應(yīng)④特異性表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmuno80Western印跡法Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定融為一體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。它具有很高的靈敏性，可從植物細(xì)胞總蛋白中檢測(cè)出50ng的特異蛋白質(zhì)。若是提純的蛋白質(zhì)，可檢至1～5ng。原理：轉(zhuǎn)化的外源基因正常表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞中含有一定量的目的蛋白。從植物細(xì)胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-聚