耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的藥物敏感性及碳青霉烯酶基因攜帶情況分析

肺炎克雷伯菌是一種常見的致病性感染，占所有革蘭氏陰性感染的1.3%。它可能導致腸外感染，包括尿道炎、膀胱炎、肺炎、肝腫、內(nèi)源性眼內(nèi)炎、手術(shù)傷口感染和生命感染，以及病毒性心內(nèi)膜炎和并發(fā)癥。碳青霉烯類抗菌藥物是臨床上治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌引起的感染最有效的藥物。產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（CPKP）是最重要的產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌（CPE）之一，并且已廣泛傳播到世界各地1材料和方法1.1中小型碳青霉烯類肺炎克雷伯菌收集本院2018年1月至2019年2月期間分離臨床標本中非重復耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌95株。標準菌株：大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706。1.2菌株和培養(yǎng)基干粉采用法國梅里埃Vitek2-Compact全自動細菌鑒定儀鑒定細菌和藥敏，K-B紙片法進行藥敏試驗復核（亞胺培南和美羅培南），藥敏紙片及MH培養(yǎng)基干粉均購自英國Oxiod公司。藥敏結(jié)果采用CLSI2018標準進行判斷，質(zhì)控菌株為ATCC25922。1.3碳綠霉烯的共燃燒試驗1.3.1抑菌圈直徑的測定按照CLSIM100-S28方法操作，取1μL接種環(huán)的生長于血瓊脂平板上的過夜培養(yǎng)純菌落，于2mLTSB肉湯中，震蕩混勻10～15s。每管放入1張含美羅培南10μg的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中，在（35±2）℃大氣環(huán)境孵育（4.00±0.25)h。孵育結(jié)束時，立即用營養(yǎng)肉湯或0.9%NaCl制備0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC25922懸液，菌懸液制備和平板涂布必須15min內(nèi)完成，干燥3～10min。用10μL接種環(huán)將美羅培南紙片從TBS肉湯中取出，將紙片貼于試管內(nèi)壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MHA平板上，每個100mm的MHA平板最多貼4張紙片。倒置平板，（35±2）℃大氣環(huán)境孵育18～24h，量取抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：美羅培南抑菌圈直徑為6～15mm或直徑為16～18mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落為碳青霉烯酶陽性；抑菌圈直徑≥19mm為碳青霉烯酶陰性；抑菌圈直徑為16～18mm或直徑為≥19mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落為碳青霉烯酶中性。無法判斷是否存在碳青霉烯酶。1.3.2ta結(jié)果判定按照CLSIM100-S28方法操作。取第2支含TSB2mL的肉湯管，管壁上標記細菌名稱，加入20μL0.5mol/LEDTA溶液于2mLTSB中，ED-TA最終濃度為5mmol/L。剩下步驟同mCIM實驗步驟，mCIM和eCIM實驗同步進行。mCIM和eCIM實驗管中的美羅培南紙片貼于同一塊已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MHA平板上。結(jié)果判讀：與mCIM結(jié)果相比，美羅培南抑菌圈直徑≥5mm為金屬酶陽性，≤4mm為金屬酶陰性。對于eCIM，忽略任何抑菌圈內(nèi)的散在針尖樣菌落，且僅當mCIM結(jié)果呈陽性時，eCIM結(jié)果才有效；mCIM結(jié)果陰性時，不解釋eCIM結(jié)果。當mCIM結(jié)果陽性，eCIM結(jié)果陰性的情況下報告絲氨酸碳青霉烯酶陽性。1.4pcr擴增活性檢測kpc、imp、nda、oxa48基因表達采用美國賽沛GeneXpert分子診斷系統(tǒng)，Xpert是實時熒光定量PCR快速檢測，基于實時PCR技術(shù)，與配套的Xpert檢測試劑共同使用，本實驗采用XpertCarba-R試劑盒，用對數(shù)生長期的菌株配制0.5mol/L生理鹽水稀釋液，吸取10μL加入樣本處理液中，旋渦震蕩約10s，吸取約1.7mL混合液加入試劑盒中，蓋上試劑盒蓋子，啟動檢測。此方法檢測KPC、IMP、VIM、NDM、OXA48基因。該試劑盒有一個樣本處理對照（SPC）來確保PCR反應的條件（溫度和時間），使其擴增有效。另外有一個內(nèi)質(zhì)控，即探針檢查控制（PCC），可以驗證盒中的PCR管填充，探針完整性及染料的穩(wěn)定性。以肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705作為絲氨酸碳青霉烯酶陽性對照，以一株測序NDM基因陽性的肺炎克雷伯菌株作為金屬酶陽性對照，以肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706作為碳青霉烯酶陰性對照。1.5統(tǒng)計處理2結(jié)果2.1防水性青霉肺炎的克雷伯病理特征2.1.1血液、引流液和混合物95株CRKP的標本來源以痰液為主，共有43株，占45.3%，其次為血液、引流液和分泌物，分別有18株（18.9%）、16株（16.8%）、9株（9.5%）。CRKP標本的主要來源于中老年人，40～<60歲占46株，60～<90歲占24株。見表1。2.1.2門診患者和其他科室的診前時間CRKP感染患者主要來自ICU,52例占總體的54.7%，門診患者12例占12.6%，其次是燒傷科、消化科、其他科室各8例占8.4%，神經(jīng)內(nèi)科4例占4.2%、神經(jīng)外科3例占3.2%。2.2抗菌藥物的耐藥率分離的95株CRKP對替加環(huán)素的敏感率為96.9%，對四環(huán)素、多西環(huán)素的耐藥率較低（均<30%），其次為阿米卡星和復方磺胺甲噁唑（80.6%和82%），對其他抗菌藥物表現(xiàn)為高耐藥率，耐藥率均>90%。見表2。2.3碳青霉酶基因檢測、mci和ecim的結(jié)果2.3.1絲氨酸碳青霉烯酶表型試驗檢測結(jié)果顯示：圖1AmCIM陽性，eCIM陰性，提示絲氨酸碳青霉烯酶陽性；圖1BmCIM陽性，eCIM陽性，提示金屬酶陽性。本研究改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM)91株陽性，EDTA改良碳青霉烯滅活試驗（eCIM)3株陽性。部分檢測結(jié)果見圖1。2.3.2碳青霉烯類基因檢測PCR主要檢測5種基因型，分別是KPC、NDM、IMP、VIM、OXA48。在95株耐碳青酶烯類的肺炎克雷伯菌中92株基因為陽性，未檢測出耐藥基因的菌株有3株。其中86株含有KPC基因，3株含有NDM基因，3株既含有KPC又含有NDM基因，95株均未檢測出IMP、VIM、OXA48基因。mCIM檢測到92株碳青霉烯類基因陽性菌株中91株為陽性菌株，3株基因陰性菌均為陰性，1株P(guān)CR顯示含KPC基因的菌株mCIM檢測為中性。在mCIM陽性的基礎(chǔ)上進一步解釋eCIM結(jié)果，eCIM檢測出的陽性菌株3株，陰性菌株有88株，3株同時含有KPC基因和NDM基因的菌株mCIM檢測為陽性，但eCIM檢測均為陰性。見表3。3碳青霉烯酶藥敏試驗CRE自出現(xiàn)以來已成為院內(nèi)感染患者死亡的主要原因之一。CRE也被認為是威脅世界公共衛(wèi)生最重要的一類病原菌。因此，準確快速地鑒定CRE對于個體治療及感染控制方面至關(guān)重要。根據(jù)以往研究，產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制，目前在腸桿菌科細菌中常見的碳青霉烯酶主要有KPC、IMP、VIM、NDM和OXA-48等。CRE主要在肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，而CRKP占CRE的比例最大本研究顯示，碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對多數(shù)臨床常用抗菌藥物高度耐藥，多數(shù)為僅對替加環(huán)素敏感菌株。為應對此類超級耐藥細菌所致感染，實驗室應積極與臨床溝通，增做其他可能有效的抗菌藥物如多黏菌素、替加環(huán)素和頭孢他啶-阿維巴坦的藥敏試驗。但微生物實驗室人員在進行藥敏試驗時，需特別注意多黏菌素和替加環(huán)素的藥敏試驗方法存在的問題。多黏菌素藥敏試驗方法目前CLSI不推薦紙片法、瓊脂稀釋法等其他藥敏方法，必須用微量肉湯稀