氣相色譜法測定全血中的巴特妥

巴比妥藥物通常用于鎮(zhèn)靜劑和安眠藥。巴比特是巴比特常用的藥物之一。有效血藥濃度為15g。ml，高于100g。如果你服用5.10克，你會死于中毒。死亡的血藥濃度約為34160g/ml。1材料和方法1.1渦流混合器型氣相色譜儀(GC-2010型,附帶氫火焰離子化檢測器(FID)和色譜工作站GC-solution,日本島津公司),高速臺式離心機(TGL-16C型,上海安亭科學(xué)儀器廠),漩渦混合器(VDRTEX-5型,海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:171220-200602),苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:171222-200605),巴比妥鈉(分析純,天津市科歐密化學(xué)試劑有限公司,批號:Q/12HB3592-2002),無水乙醇[分析純,重慶川東化工(集團)有限公司化學(xué)試劑廠,批號:20001016],偏磷酸[分析純,重慶川東化工(集團)有限公司化學(xué)試劑廠,批號:20070424],實驗用水為Milli-Q超純水(>18MΩ·cm)。1.2工作液的配制室溫下精密配制10mg/mL巴比妥乙醇溶液,5mg/mL苯巴比妥乙醇溶液,密封于4℃冰箱內(nèi)保存,臨用時稀釋成系列工作液。分別精密稱取巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品和苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品100mg和50mg,置10mL容量瓶中,用乙醇溶解并定溶,得10mg/mL巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲備液和5mg/mL苯巴比妥內(nèi)標(biāo)儲備液,貯存于4℃?zhèn)溆?臨用時稀釋成系列工作液。1.3進標(biāo)、管壓、空氣溫度色譜柱:AEOV-1701毛細(xì)管柱(50m×0.25mm×0.33μm),程序升溫:柱起始溫度180℃,保持1min,以30℃/min的速度升至260℃,保持15min;進樣口溫度:270℃;檢測器溫度:280℃;載氣:氮氣,純度不小于99.99%;柱前壓:227.8kPa;柱流量:1.5mL/min;隔墊吹掃流量:3mL/min;空氣:300mL/min,氫氣:30mL/min,尾吹氣:30mL/min;分流比:100∶1;進樣量1μL。1.4樣品采集與預(yù)處理1.4.1巴比妥鈉水溶液配制正常SD雄性大鼠(338g,來源于貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)灌服4mL濃度為15mg/mL巴比妥鈉水溶液(臨用時配制),6h后心臟采血,裝于密閉抗凝管中,-20℃保存。1.4.2苯巴比妥乙醇溶液、監(jiān)管劑溶液取血液樣品0.5mL,置2mL聚丙烯離心管中,加入5mg/mL苯巴比妥乙醇溶液50μL、無水乙醇0.5mL、5%偏磷酸溶液0.5mL,漩渦混合器混合5min,4000r/min離心5min,取1μL上清液進樣。2結(jié)果2.1樣品預(yù)處理方法各取0.5mL空白血液分別裝于3支2mL聚丙烯離心管中,其中一管作為空白陰性對照,一管加入250μg苯巴比妥溶液,另一管加入200μg巴比妥溶液和250μg苯巴比妥溶液,按“1.4.2”的樣品預(yù)處理方法制備供試液,各取1μL進樣分析。結(jié)果顯示,溶劑峰、巴比妥峰和苯巴比妥峰的保留時間分別為2.28、5.54和10.89min,三者峰完全分離,且巴比妥峰與苯巴比妥峰的保留時間相近,空白無干擾,滿足定量分析要求。色譜圖見圖1~3。2.2線性范圍考察根據(jù)實際工作需要,擬設(shè)大于5倍中毒劑量為線性上限,考察血液中巴比妥質(zhì)量濃度在0~500μg/mL之間的線性關(guān)系,制備每毫升血液含0、5、10、40、80、200、500μg巴比妥的樣品,分別按“1.4.2”的方法操作,以巴比妥濃度值為X軸,巴比妥與苯巴比妥峰面積比值(A巴比妥/A苯巴比妥)為Y軸,得回歸方程:y=0.0014x-0.0003,r=1.0000。結(jié)果表明,血液中巴比妥質(zhì)量濃度在0~500μg/mL范圍線性良好。另制備12份每毫升血液含5μg巴比妥的樣品,按“1.4.2”的方法操作,計算巴比妥與苯巴比妥峰面積比值(A巴比妥/A苯巴比妥)的標(biāo)準(zhǔn)偏差,再根據(jù)3倍信噪比計算,得此方法的檢出限為1.6μg/mL,小于巴比妥的治療有效血藥濃度,可滿足實際鑒定需要。2.3方法回收率和精密度結(jié)合臨床診斷與司法鑒定實際檢測需要,在線性范圍內(nèi),擬設(shè)小于治療濃度、大于中毒濃度和線性上限濃度3個回收率和精密度考察點,制備血液中巴比妥濃度為10、80和500μg/mL的樣品,按“1.4.2”的方法操作,每一濃度每天平行測定6份,以當(dāng)天巴比妥的相對校正因子計算得實測濃度,與樣品濃度比較,計算方法回收率,并獲得日內(nèi)精密度,連續(xù)測定5d,獲得日間精密度。結(jié)果表明,本方法回收率為96.5%~104.0%,日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%,符合定量檢測方法學(xué)要求。結(jié)果見表1。2.4回收率、精密度與穩(wěn)定性制備低、中、高3種濃度的血液樣品,分別考察在室溫密閉放置8h、-20℃密閉保存30d(期間反復(fù)凍融3次)和血樣按“1.4.2”的方法操作處理后常溫密閉放置8h的穩(wěn)定性,每個穩(wěn)定條件平行測定5份。結(jié)果表明,在上述穩(wěn)定條件下,回收率為97.0%~102.0%,精密度小于10%,血液樣品在室溫、長時間冷凍并反復(fù)凍融情況下穩(wěn)定性均較好,能滿足樣品儲存需要;樣品處理后的供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定,能滿足正常檢測時間需要,可同時處理多批樣品。結(jié)果見表2。2.5測定巴比妥的含量分別取0.5mL空白血液和“1.4.1”制備樣品各3份,其中每份空白加入250μg巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.4.2”的方法操作,測定巴比妥的相對校正因子及樣品中巴比妥的含量,測得樣品中巴比妥的含量為209.34μg/mL,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%,方法重