PAGEPAGE268第八章農(nóng)藥多殘留分析8.1概述農(nóng)藥多殘留方法（Multi-residuemethods,MRMs）是在一次分析中同時測定一種以上農(nóng)藥殘留的方法。從20世紀80年代以來，隨著分離、測定技術的快速進展，尤其是毛細管色譜柱、多種高靈敏度、選擇性色譜檢測器、質(zhì)譜檢測器以及色質(zhì)聯(lián)用技術的成熟與普及應用，農(nóng)藥多殘留分析技術得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應用。農(nóng)藥多殘留分析主要分為兩類，如果建立的多殘留分析方法或進行的檢測是針對多種不同類型農(nóng)藥進行的，則稱為多類多殘留方法（MulticlassMRMs），只檢測性質(zhì)相近的某類農(nóng)藥的多殘留分析，稱為選擇性多殘留方法（SelectiveMRMs），也叫單類多殘留方法。多類多殘留方法的應用范圍主要是針對未知用藥歷史的樣品，經(jīng)常用于管理機構對食品和環(huán)境介質(zhì)的檢測、監(jiān)督和殘留限量執(zhí)行情況。多類多殘留方法應該能夠覆蓋最廣泛的農(nóng)藥殘留，但這種分析能力受到以下幾個因素的影響：（1）提取溶劑體系能夠?qū)⒍嗌俜N農(nóng)藥殘留從樣品中提取出來的廣泛性，以及提取的徹底性；（2）凈化過程去除樣品共提取物（即雜質(zhì)）而不去除殘留農(nóng)藥的能力；（3）測定儀器對各類各種農(nóng)藥的分離和響應能力以及分析測定步驟的多少。因為分析步驟越多，越容易造成殘留農(nóng)藥的損失，或減少可檢出殘留農(nóng)藥的數(shù)目。在進行農(nóng)藥多殘留分析時，分析人員應用的方法應該是已確認（Validation）的方法。由于多殘留方法在提取、凈化和測定的過程中根據(jù)不同樣品基質(zhì)的性質(zhì)有多種不同的模式組合可供選擇，分析人員需要結合其它模式優(yōu)化分析過程。但任何組合都必須有在其應用條件下確認根據(jù)的支持。如果是研究新的分析方法，研究人員則要評價分析方法的每一步驟，根據(jù)最佳效能作出方法選擇。新形成的方法必須經(jīng)過確認，特別是多實驗室的確認評價試驗。在農(nóng)藥多殘留分析過程中，有以下幾個技術問題需要注意：⑴.為了最大限度地檢出所分析的未知用藥歷史樣品中的農(nóng)藥殘留種類，先測定未凈化的提取液，尤其是應用選擇性的檢測器測定未凈化的提取液，測定之后再對提取液凈化。⑵.當提取物色譜圖出現(xiàn)峰時，通過檢索峰的相對保留時間等有關資料進行初步確證，再通過選擇性多殘留方法和質(zhì)譜等方法進行一致性確證。⑶.要充分了解某些特別難以提取的殘留農(nóng)藥，例如在多類多殘留分析或在單類多殘留分析時有機磷農(nóng)藥的極性殘留甲胺磷往往提取的回收率較低，在這種情況下，要在分析方法和結果部分加以注釋說明。必要時用另外的方法或修改方法對這些殘留重作分析。8.2農(nóng)藥多類多殘留方法（MulticlassMRMs）8.2.1美國食品藥品管理局方法（FDA-PAM法）1．非脂肪性樣品丙酮提取法：本方法可應用于非脂肪食品中的非離子型農(nóng)藥多殘留分析。⑴．提取①.含水量＞75%的植物或其它食品稱取100g切碎或搗碎的樣品于勻漿機中，加200mL丙酮，高速勻漿2min，用丙酮預洗過的濾紙（SharkSkin）置于12cm布氏漏斗，將混合物抽濾，收集濾液于500mL抽濾瓶內(nèi)。過濾一般在1min內(nèi)完成，時間過長會造成提取液體積減少引起計算誤差。將80mL提取液置于1L的分液漏斗，加100mL石油醚和100mL二氯甲烷，用力振搖1min。將下層水相轉(zhuǎn)移至第二個1L的分液漏斗，將第一個分液漏斗中的上層相通過在預洗玻璃棉上裝有4cm無水硫酸鈉的漏斗（直徑10cm）脫水，收集于K-D濃縮瓶中。在裝有水相的第二個分液漏斗加7g氯化鈉，用力振搖30s至氯化鈉基本溶解，加100mL二氯甲烷，用力振搖1min，下層有機相過同一無水硫酸鈉漏斗脫水后進入K-D濃縮瓶；水相用100mL二氯甲烷提取，有機相過同上無水硫酸鈉漏斗脫水后并入K-D濃縮瓶，再用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉，在K-D濃縮瓶中加適量沸石，先將濃縮瓶接收管置于蒸汽上慢慢濃縮，當有100-150mL的提取溶劑蒸發(fā)以后，可使?jié)饪s器接觸更多蒸汽，當濃縮液至約2mL時通過施奈德柱加100mL石油醚再濃縮至約2mL，加50mL石油醚再濃縮至約2mL，加20mL丙酮再濃縮至約2mL，濃縮過程中不得讓溶劑蒸發(fā)至干。用丙酮將提取液調(diào)節(jié)到適當?shù)捏w積。計算定容提取液中相應的樣品量：=100××其中：100=分析樣品量（g）80=液液分配時移取的提取液體積（mL）200=100g樣品中加的丙酮體積（mL）w=樣品中含水量（mL）（見相關文獻，如果特殊的未加工的農(nóng)產(chǎn)品得不到含水量數(shù)據(jù)，按85%計。）10=水/丙酮體積縮減得調(diào)節(jié)值（mL）。例如，某樣品含水量85%，定容體積7mL，則每含的樣品量為：100××=4.15mg/②.含水量低于﹤75%得植物或其它食品稱取15g粉碎的樣品（﹤20目）于勻漿機中，加350mL35%水/丙酮，高速勻漿2min，用丙酮預洗過的濾紙（SharkSkin）置于12cm布氏漏斗，抽濾混合液，收集濾液于500mL抽濾瓶內(nèi)，過濾一般在1min內(nèi)完成，時間過長會造成提取液體積減少造成計算誤差。將80mL提取液轉(zhuǎn)入盛有100mL二氯甲烷的1L分液漏斗中，加100mL石油醚，用力振搖1min，將下層水相轉(zhuǎn)入第二個1L分液漏斗。將第一個分液漏斗中的有機相通過在預洗玻璃棉上裝有4cm無水硫酸鈉的漏斗（直徑10cm）脫水，收集于K-D濃縮瓶中。在裝有水相的第二個分液漏斗加7g氯化鈉，用力振搖30s至氯化鈉基本溶解，加100mL二氯甲烷，用力振搖1min，下層有機相過同一無水硫酸鈉漏斗脫水后收集于K-D濃縮瓶。再加100mL二氯甲烷同上提取水相和過硫酸鈉漏斗脫水后并入K-D濃縮瓶，再用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉，淋洗液并入K-D濃縮瓶。在K-D濃縮器中加沸石后濃縮，先將濃縮瓶接收管置于蒸汽上慢慢濃縮，當濃縮液至約2mL時通過施奈德柱加100mL石油醚再濃縮至約2mL，加50mL石油醚再濃縮至約2mL，加20mL丙酮再濃縮至約2mL，濃縮過程中不得讓溶劑蒸發(fā)至干。用丙酮將提取液調(diào)節(jié)到適當?shù)捏w積。計算定容提取液中相應的樣品量：=15××其中：15=分析樣品量（g）80=液液分配時移取的提取液體積（mL）如果最后提取液定容體積為2mL，則每μL含的樣品量為：15××=1.7mg/⑵.凈化①.弗羅里硅土柱凈化，二氯甲烷淋洗稱取4g活化過的弗羅里硅土（月桂酸值110）裝入10mm內(nèi)徑×300mm的層析柱，上加約2cm無水硫酸鈉，打開活塞，輕敲層析柱使吸附劑均實。用15mL己烷預濕柱子，不讓柱子流干。用具刻度收集管的K-D濃縮器接收淋洗液。用己烷稀釋提取液，使成為10%的丙酮/己烷溶液（例如，取1mL丙酮濃縮液，以己烷定容至10mL）。將此溶液轉(zhuǎn)移到柱子上，流速約5mL/min。用3mL己烷潤洗容器壁兩次，過層析柱，再用少量己烷淋洗層析柱壁。用50mL淋洗液（50%二氯甲烷∶1.5%乙腈∶48.5%己烷，v/v/v）以約5mL/min流速淋洗層析柱。濃縮：在K-D濃縮器中加適量沸石，濃縮淋洗液至適當體積，一般與凈化前移取的提取液體積一致，例如，凈化前移取1mL濃縮的提取液稀釋成10mL10%的丙酮/己烷溶液，凈化后的淋洗液也濃縮為1mL。定容待測。②.弗羅里硅土柱凈化，乙醚/石油醚淋洗在22mm內(nèi)徑的層析柱內(nèi)加活化過的弗羅里硅土約10cm（或根據(jù)月桂酸值決定用量），再加入約1.5cm的無水硫酸鈉。用40-50mL石油醚預浸潤柱子。用具刻度收集管的K-D濃縮器接收淋洗液。用丙酮稀釋濃縮后的提取液至10mL并轉(zhuǎn)移到100mL具塞量筒中，用石油醚潤洗容器，再用石油醚稀釋到100mL；塞緊，混勻。轉(zhuǎn)移稀釋后的提取液到柱子上，使其流速約5mL/min。用200mL15%乙醚/石油醚以約5mL/min的速率淋洗層析柱。更換K-D瓶，用200mL50%乙醚/石油醚淋洗，淋洗速率約5mL/min在K-D濃縮瓶中加入沸石，濃縮淋洗液至所需要的量。例如，提?、欧ㄌ崛∫褐械暮繛?5%，最終定容體積是5mL，凈化后溶液的濃度是5.8mg/μL，即，100×80/（200+85-10）=29g，29g/5mL=5.8mg/μL。需要體積小于5mL時，用雙球微Snyder柱或微型Vigreaux柱。定容后待測。③.固相提取柱（SPE）凈化此凈化法對于具毛細管柱的氣相色譜檢測具有更好的凈化效果，對極性和非極性殘留物都有很好的回收。在75mL的容器內(nèi)放0.45μm濾膜，把SAX或代替品于濾膜上，再把PSA或代替品接到第一個柱子上。用40mL丙酮潤洗柱子；接著用10mL丙酮/石油醚（1/2,v/v）淋洗，棄去洗脫液。用10mL石油醚稀釋5mL濃縮的丙酮提取液并混合，轉(zhuǎn)移到容器里，用加壓淋洗，用少量丙酮/石油醚（1/2,v/v）潤洗管子5次，在前一次的潤洗液至柱子頂端時再進行下一次的淋洗?；旌螷-D瓶收集液，加沸石濃縮溶劑；開始慢慢蒸發(fā)，僅在蒸汽中放收集管。當濃縮至收集管中約2mL溶劑時，通過施奈德柱加100mL石油醚再濃縮至2mL左右，再加50mL石油醚濃縮至2mL左右。小心加25mL丙酮濃縮至2mL左右。在濃縮過程中，不得讓溶劑蒸發(fā)至干。最后用丙酮定容到所需體積。SPE柱：75mLBondElut具貯液杯；25mm注射過濾器，0.45μm尼龍66具1μm預過濾SAXSPE柱或替代品，500mgPSASPE柱或替代品，500mg乙腈提取法：本方法適合應用于非脂肪樣品中相對非極性農(nóng)藥多殘留分析。⑴．提取①.含水量＞75%、含糖＜5%的植物或其他食品稱取100g切碎混勻的樣品于勻漿瓶內(nèi)，加200mL乙腈，（可以加10gCelite助濾劑）。高速勻漿2min，經(jīng)鋪有濾紙的布氏漏斗真空抽濾，轉(zhuǎn)移濾液于250mL量筒，記錄體積(F)后將定量的濾液轉(zhuǎn)入1L的分液漏斗。用同一量筒準確量取100mL石油醚，倒入分液漏斗中，劇烈振搖提取1-2min。加10mL飽和氯化鈉溶液及600mL水。橫握分液漏斗劇烈振搖30-45秒（混合不充分可能會導致一些農(nóng)藥回收率低，如六六六，TDE）。靜置分層后，棄去水相，用水輕輕沖洗有機相2次，每次100mL。棄去沖洗水液，有機相轉(zhuǎn)入100mL具玻塞量筒，記錄體積（P）。加15g硫酸鈉于量筒內(nèi)，蓋緊塞子，用力振搖，提取液與硫酸鈉在一起的時間不要超過1h，否則會因吸附造成有機氯農(nóng)藥的損失。將溶液直接過弗羅里硅土柱凈化，或在K-D濃縮器先濃縮至5-10mL后再過弗羅里硅土柱。按下式計算過弗羅里硅土柱的樣品重量（G）S=提取的樣品的重量（g）；F=過濾后乙腈提取液的體積；T=總體積（樣品中水份的量mL+添加乙腈的量mL。要校正體積縮小毫升數(shù)）。80-95mL水和200mL乙腈的縮小體積為5mL。P=回收的石油醚提取液體積（mL）；100=殘留農(nóng)藥分配進入的石油醚的體積；大多數(shù)水果和蔬菜含水量可認為是85%。②.鮮蛋類將合在一起整蛋的蛋黃和蛋白低速攪拌至少5min，至樣品均勻為止。低速攪拌，可使樣品起泡最少。稱取≤25g徹底混勻的蛋黃和蛋白，放入勻漿瓶，加200mL乙腈。繼續(xù)按①“高速勻漿2min…”同樣處理。計算加入弗羅里硅土柱凈化的樣品量（G）時，除T=215（25g全蛋中15mL水與200乙腈，縮小體積忽略不計）外，其余均同①計算。③.含水量＜75%的植物或其他食品磨碎樣品并過20目篩稱取20-25g樣品放入勻漿瓶，加350mL含水35%的乙腈（加10g助濾劑Celite）。如果樣品量需要較多，可另加足量的提取混合液，使其濕潤且可以徹底混合。高速攪拌5min，經(jīng)放有濾紙的布氏漏斗，抽濾至抽濾瓶內(nèi)。取≤250mL濾過的提取液，記錄體積（F），繼續(xù)按①，“將定量的濾液轉(zhuǎn)至1L分液漏斗，…”同樣處理。同①計算加入弗羅里硅土柱樣品的克數(shù)，除T為樣品中水的毫升數(shù)+含35%水的乙腈的毫升數(shù)。忽略體積縮小的校正數(shù)。如果樣品含水量＜10%直接等于混合提取液的體積。④.含水量＞75%，含糖5~15%的植物或其它食品稱取100g樣品于勻漿瓶內(nèi)，加200mL乙腈和50mL水。高速勻漿2min，經(jīng)放有濾紙的布氏漏斗抽濾入抽濾瓶內(nèi)。轉(zhuǎn)移≤250mL過濾后的提取液于250mL的量筒中。記錄體積（F），繼續(xù)按①，“把定量濾液移入1L分液漏斗，…”同樣處理。同①計算加入弗羅里硅土柱的實測樣品的克數(shù)，除T為樣品中水的毫升數(shù)+所加乙腈的毫升數(shù)+添加水的毫升數(shù)（要校正體積縮小的毫升數(shù)）。當添加50mL水時，在含水量為85%的食品中T是325，因為80-95mL的水和200mL乙腈混合后縮小體積為5mL。⑤.含水量＞75%，含糖＞15%的植物或其它食品稱取100g樣品于勻漿瓶內(nèi)，加入已加熱的（75℃）200mL乙腈和50mL水的混合液。例如要分析葡萄干，稱取50g樣品，分別加熱50mL水和200mL乙腈至75℃。加40-50mL熱水至稱量葡萄干的容器內(nèi)，攪拌或搖晃使葡萄干在水中分散均勻。轉(zhuǎn)移到勻漿瓶，用剩下的水沖洗容器，并入勻漿瓶內(nèi)，再用熱的乙腈沖洗容器，并入勻漿瓶內(nèi)，最后把剩余的乙腈都倒入勻漿瓶內(nèi)。高速攪拌2min，經(jīng)放有濾紙的布氏漏斗抽濾入抽濾瓶內(nèi)。在熱的濾液變冷之前，轉(zhuǎn)移≤250mL經(jīng)過濾后的提取液于250mL的量筒中。記錄體積（F）。繼續(xù)按①，“把定量濾液移入1L分液漏斗，…”同樣處理。同①計算加入弗羅里硅土柱的實測樣品的克數(shù)，除T為樣品中水的毫升數(shù)+所加乙腈的毫升數(shù)+添加水的毫升數(shù)。（要校正體積縮小的毫升數(shù)）。當添加50mL水時，在含水量為85%的食品中T是325，因為80-95mL的水和200mL乙腈混合后縮小體積為5mL。⑵.凈化①.弗羅里硅土柱層析凈化在22mm內(nèi)徑的層析柱內(nèi)加活化過的弗羅里硅土約10cm（或根據(jù)月桂酸值決定用量），再加約1.5cm的硫酸鈉，用40-50mL石油醚預浸潤柱子。用具刻度管的K-D瓶接收淋洗液。將樣品提取液轉(zhuǎn)移到柱子上，使其流速約5mL/min。用5mL石油醚淋洗容器和硫酸鈉（如果有硫酸鈉）兩次，轉(zhuǎn)移淋洗液到柱子上，再用另外的少量石油醚淋洗層析柱的內(nèi)壁。用200mL6%乙醚/石油醚的淋洗液淋洗層析柱，淋洗速率約5mL/min；更換K-D瓶，用200mL15%乙醚/石油醚淋洗，淋洗速率約5mL/min；更換K-D瓶，用200mL50%乙醚/石油醚淋洗，淋洗速率約5mL/min。在K-D濃縮瓶中加入沸石，濃縮淋洗液至所需要的合適的量。濃縮的量要求小于5mL時，需要使用雙球微Snyder柱或微型Vigreaux柱。定容后待測。②.弗羅里硅土柱層析備擇方法同①準備弗羅里硅土柱。樣品提取液轉(zhuǎn)移到柱子上，使其流速約5mL/min。用5mL己烷淋洗容器和硫酸鈉（如果有硫酸鈉）兩次，轉(zhuǎn)移淋洗液到柱子上，再用另外的少量己烷淋洗層析柱內(nèi)壁；用200mL洗脫液（20%二氯甲烷/己烷,v/v）以約5mL/min的速率淋洗層析柱；更換K-D瓶，用200mL洗脫液（50%二氯甲烷/0.35%乙腈/49.65%己烷,v/v/v）以約5mL/min的速率淋洗層析柱；更換K-D瓶，用200mL洗脫液（50%二氯甲烷/1.5%乙腈/48.5%己烷,v/v/v）。以約5mL/min的速率淋洗層析柱；在K-D濃縮瓶中加沸石，濃縮各淋洗液至適量。濃縮的量需要小于5mL時，用雙球微Snyder柱或微型Vigreaux柱；定容后待測。選用合適的檢測方法對殘留物進行定性和定量測定。2.脂肪性樣品⑴.魚和動物組織提取方法稱取25~50g完全磨碎混勻的魚和動物組織于勻漿器中（樣品量按凈化過程適合的脂肪量加以調(diào)節(jié)），加入100gNa2SO4。交替用刀片混勻樣品和無水硫酸鈉。刮下器壁上樣品，搗碎結塊組織。加入150ml石油醚高速勻漿2min。在布氏漏斗中加兩層濾紙，倒出石油醚上清液，真空抽濾。用刀片刮下殘余樣，弄碎結塊組織。勻漿器中殘余樣品再用石油醚提取兩次，每次用量100mL勻漿2min.（勻漿1min后，刮下殘余樣，粉碎結塊組織，繼續(xù)勻漿1min）。抽濾，與第一次有機相混合。最后一次勻漿后，將勻漿瓶中殘渣倒入布氏漏斗，分三次每次用25-50mL石油醚淋洗勻漿瓶和布氏漏斗中殘渣，在最后淋洗結束時，立即用干凈燒杯底部擠壓布氏漏斗，擠出殘存的石油醚。將全部的提取液和淋洗液通過25mm×50mm硫酸鈉層析柱，用K-D濃縮器收集濾液，用少量石油醚淋洗抽濾瓶和層析柱。在K-D瓶中加入沸石，蒸去大部分石油醚。魚和動物組織的小樣量提取方法：稱取20g完全磨碎混勻的魚或動物組織于勻漿杯中。將用石油醚預潤濕的40g硫酸鈉加入樣品中；用玻棒混勻樣品，靜置20min，再混勻；加100mL石油醚于樣品中，勻漿1-2min；將平衡過的勻漿杯以2000rpm離心1-2min，得到澄清的石油醚提取物；漏斗中塞入玻璃棉，加入20g無水硫酸鈉，放在250ml容量瓶上。倒出石油醚提取液，過無水硫酸鈉；再加入100ml石油醚于樣品中，玻棒混勻，如前提取一次；再用70ml石油醚提取一次。3次提取液合并于250ml容量瓶中；用石油醚稀釋定容。⑵.魚和動物組織凈化①.原理為避免在凈化過程中出現(xiàn)超凈化能力的現(xiàn)象，應細心稱量提取出的脂肪量。經(jīng)過乙腈和石油醚液-液分配，可以將脂肪中的殘留農(nóng)藥分離出來。在乙腈和石油醚分配體系中，大多數(shù)脂肪留在石油醚相，而殘留農(nóng)藥則進入乙腈相中。當向乙腈相中加入水時，可以降低農(nóng)藥在乙腈中的溶解度，使乙腈相中殘留農(nóng)藥重新分配到石油醚相中。在弗羅里硅土吸附柱上將溶液中殘留農(nóng)藥從樣品共提物中分離出來；用極性遞增的淋洗液將柱上的農(nóng)藥殘留洗脫下來。②.測定脂肪量凈化方法可用于≤3g脂肪。從提取的脂肪溶液中蒸發(fā)掉溶劑后，按下列操作步驟之一來測定提取的脂肪量：當樣品中總脂肪含量＞3g時，并且分析的殘留農(nóng)藥是不易揮發(fā)的，可用少量石油醚將濃縮提取液轉(zhuǎn)移到已稱量的燒杯中，用干空氣流在蒸汽溫度下吹干。稱量并記錄提取脂肪的質(zhì)量。取≤3g的脂肪用于凈化。按下式計算分析樣品的重量：當已知樣品中的脂肪含量＜3g時，不必進一步蒸發(fā)溶劑，凈化全部脂肪溶液樣品。以原樣重量為分析樣品重量。當已知脂肪含量＞3g或者殘留水平很高時，不必進一步蒸發(fā)溶劑，取已知、適量體積的提取溶液，轉(zhuǎn)入已稱量的燒杯中。蒸掉溶劑，稱量測定脂肪含量。凈化含有≤3g脂肪，按下式計算分析樣品的重量：當需要分析揮發(fā)性物質(zhì)時，不能在蒸汽浴的溫度下蒸發(fā)石油醚。取已知、適量體積的溶液，轉(zhuǎn)移到已稱重的燒杯中。蒸掉溶劑，稱量測定脂肪含量。凈化剩余的溶液或適量的部分試樣。按下式計算分析樣品的重量：×樣品重量③.乙腈/石油醚液液分配稱取≤3g脂肪放入125mL的分液漏斗中，添加石油醚使分液漏斗中的脂肪和石油醚總體積為15ml。如果液-液分配時，出現(xiàn)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的趨勢時，石油醚用量可更少。加入石油醚飽和的乙腈30mL，劇烈振搖1min，靜止分層，將乙腈相轉(zhuǎn)入已預先加入650mL水、40mL飽和氯化鈉和100mL石油醚的1L分液漏斗中。在125mL分液漏斗中用以石油醚飽和的乙腈每次30mL提取石油醚3次，每次劇烈振搖1min，將全部提取液合并于1L的分液漏斗中。將1L的分液漏斗橫置，充分混合30—45秒，靜止分層。水相轉(zhuǎn)入第二個1L的分液漏斗。在第二個1L的分液漏斗中加石油醚100mL，劇烈振搖15秒，靜止分層。棄去水相，將石油醚相合并到原先的1L分液漏斗中，并用100mL×2水洗滌。棄去洗滌液，將石油醚相通過25mm×50mm的無水硫酸鈉柱子轉(zhuǎn)入K-D瓶中。用10mL×3的石油醚依次淋洗分液漏斗和無水硫酸鈉柱。在K-D瓶中加入沸石，將合并的提取液和淋洗液濃縮至5-10mL轉(zhuǎn)移到弗羅里硅土柱，凈化。④.弗羅里硅土柱凈化方法一：在內(nèi)徑為22mm的層析柱中加活化過的弗羅里硅土約10cm（或按月桂酸值計算用量），再加約1.5cm的無水硫酸鈉。用40-50mL石油醚預濕柱子，用可定容或刻度接收瓶的K-D瓶接受淋洗液。將樣品的提取溶液轉(zhuǎn)移到層析柱上，以約5mL/min的速度通過層析柱。用2次5mL石油醚潤洗容器和硫酸鈉（如果有無水硫酸鈉），將潤洗液轉(zhuǎn)入柱子，另取少量石油醚淋洗層析柱壁。用200mL6%乙醚/石油醚的淋洗液以約5mL/min的速度淋洗層析柱；更換K-D瓶，用200mL15%乙醚/石油醚的淋洗液以約5ml/min的速度淋洗層析柱；更換K-D瓶，用200mL50%乙醚/石油醚的淋洗液以約5ml/min的速度淋洗層析柱。在K-D瓶中加入沸石，將每一種淋洗液濃縮至適當體積，待測。需要體積＜5mL時，最后的蒸發(fā)過程中，接收瓶連接二球微型Snyder或Vigreaux柱。第一種淋洗液（6%乙醚/石油醚）通常無需進一步凈化就可用于GLC檢測。方法二原理：用二氯甲烷、正己烷和乙腈的混合溶液淋洗弗羅里硅土柱。盡管層析柱中的90%的脂肪都能被第三種淋洗液淋洗下來，但結果表明第二種淋洗液比方法一中第二種淋洗液的淋洗效果更為干凈。與方法一相比本方法中的3種淋洗液可淋洗極性更大的農(nóng)藥。本方法更實用于脂類和油類的分析、硫丹殘留分析以及環(huán)氧七氯和環(huán)氧八氯的分離。淋洗液：淋洗液1：20%二氯甲烷/正己烷（V/V）。用正己烷稀釋200mL二氯甲烷，混合物達室溫時，用正己烷定容至1L。淋洗液2：50%二氯甲烷/0.35%乙腈/49.65%正己烷（V/V/V）。吸取3.5mL乙腈加入500mL二氯甲烷中，用正己烷稀釋?；旌线_室溫時，用正己烷定容至1L。淋洗液3：50%二氯甲烷/1.5%乙腈/48.5%正己烷（V/V/V）。吸取15mL乙腈加入500mL二氯甲烷中，用正己烷稀釋?；旌线_室溫時，用正己烷定容至1L。凈化步驟：除弗羅里硅土凈化按如下所述的步驟外，其余按方法一完成。在內(nèi)徑為22mm的層析柱中加活化的弗羅里硅土10cm（或按月桂酸值計算用量），再添加約1.5cm的無水硫酸鈉。用40-50mL石油醚預淋柱子，用可定容或刻度接收瓶的K-D瓶接接收淋洗液。將樣品提取溶液轉(zhuǎn)移到層析柱上，并以約5mL/min的速度通過層析柱。用5mL×2正己烷潤洗容器和硫酸鈉（如果有無水硫酸鈉），將潤洗液轉(zhuǎn)入柱中，另取少量正己烷淋洗層析柱壁。用200mL淋洗液1以約5mL/min的速度淋洗層析柱。更換K-D瓶，用200mL淋洗液2以約5mL/min的速度淋洗層析柱。更換K-D瓶，用200m淋洗液3以約5mL/min的速度淋洗層析柱。在K-D瓶中加入沸石，將每一種淋洗液濃縮至適當體積。需要體積＜5mL時，在蒸發(fā)過程中，使用二球微型Snyder或Vigreaux柱。方法三原理：用乙醚/石油醚混合物淋洗前，用石油醚淋洗弗羅里硅土，可使多氯聯(lián)苯與大多數(shù)的殘留農(nóng)藥分離。凈化步驟說明：除在用6%乙醚/石油醚的淋洗液淋洗弗羅里硅土柱之前插入以下步驟外，其余按方法一完成。用250mL石油醚以約5mL/min的速度淋洗層析柱，更換K-D瓶。3.測定為最大幅度地檢出提取液中的農(nóng)藥殘留，將濃縮后定容的提取液不凈化直接以氣相色譜選擇性檢測器測定。然后如前凈化后再選擇以下方法測定。方法一：100%甲基硅氧烷，200℃，ECD適用性檢測方法適用于含鹵素、硫素殘留，或其它親電子的殘留物，是一個廣泛性檢測體系，但易于受雜質(zhì)的干擾。色譜柱大口徑毛細管柱，30m×0.53mmi.d.，涂布100%甲基硅氧烷，替代聚硅氧烷固定液，膜厚1~1.5μm，交聯(lián)結合，如，DB-1。操作條件：柱溫：200℃，恒溫；如果需要，調(diào)節(jié)溫度使得p，p`-DDT相對保留時間為3.1±0.06min。載氣：氦氣；調(diào)節(jié)氣流速使毒死蜱在約4.0±0.5min流出（約20mL/min）。進樣口溫度：220-250℃電子捕獲檢測器（ECD）：350℃尾吹氣：氮氣或氬氣/甲烷（95∶5），流速為30mL/min調(diào)節(jié)檢測器的電子放大器或衰減使0.15ng毒死蜱（在檢測器線性范圍內(nèi)）響應達50%FSD（fullscaledeflection）。方法二：GLC，100%甲基硅氧烷，200℃，F(xiàn)PD-P適用性檢測方法適用于含磷殘留物。特別適用于有機磷酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測。色譜柱大口徑毛細管柱，30m×0.53mmid，涂布100%甲基硅氧烷，替代聚硅氧烷固定液，膜厚1~1.5μm，交聯(lián)結合，如，DB-1。操作條件：柱溫：200℃，恒溫；如果需要，調(diào)節(jié)溫度使得乙硫磷相對保留時間為2.56±0.05載氣：氦氣；調(diào)節(jié)流速使毒死蜱約4.0±0.5min流出（約20mL/min）。進樣口溫度：220-250℃火焰光度檢測器（FPD-P）：225-250℃調(diào)節(jié)檢測器的電子放大器或衰減使1.5ng毒死蜱響應達50%FSD檢測系統(tǒng)要求1.5ng氧化樂果的響應≥50%FSD方法三：GLC，100%甲基硅氧烷，200℃，NPD適用性檢測方法適用于含氮殘留物，特別適用于三嗪類、三唑類農(nóng)藥殘留的檢測。色譜柱大口徑毛細管柱，30m×0.53mmi.d.，涂布50%苯基，100%甲基硅氧烷，替代聚硅氧烷固定液，膜厚1~1.5μm，交聯(lián)結合，如，DB-1。操作條件：柱溫：200℃，恒溫；如果需要，調(diào)節(jié)溫度使得乙硫磷相對保留時間為2.56±0.05載氣：氦氣；調(diào)節(jié)流速使毒死蜱約4±0.5min流出（約20mL/min）。進樣口溫度：220-250℃氮磷檢測器堿性珠，氮選擇性檢測器溫度：250℃調(diào)節(jié)檢測器的電子放大器或衰減使1.5ng毒死蜱的響應達50%FSD檢測系統(tǒng)要求1.5ng氧化樂果的響應≥50%FSD方法四：GLC，50%苯基，50%甲基硅氧烷，230℃，F(xiàn)PD-S適用性檢測方法適用于含硫的殘留物，特別適用于克螨特，涕必靈,乙呋草黃的殘留檢測。色譜柱毛細管柱，30mm×0.53mmi.d.，涂布50%苯基，50%甲基硅氧烷，替代聚硅氧烷固定液，膜厚1~1.5μm，交聯(lián)結合，如，DB-17。操作條件：柱溫：200℃，恒溫；如果需要，調(diào)節(jié)溫度使得乙硫磷相對保留時間為3.36±0.07載氣：氦氣；調(diào)節(jié)流速使毒死蜱約4±0.5min流出（約20mL/min）。進樣口溫度：250℃火焰光度檢測器（FPD-S）檢測器溫度：225-250℃調(diào)節(jié)檢測器的電子放大器或衰減使15ng毒死蜱響應達50%FSD

8.2.2DFGS19法（有機氯、有機磷、含氮及其它農(nóng)藥的多殘留分析）1．提?、?含水量＞70%的植物和其它食品稱取100g切碎的樣品于勻漿器中，加(100-x，x=含水量)g水和200mL丙酮，勻漿3min，加10g助濾劑(Celite)再勻漿10s。⑵.低含水量的植物樣品稱取10～50g(G)含水量為xg/100g試樣(例如，脫水水果或蔬菜25～50g，茶葉或香料10～20g，糧食50g)，加水量(W)按公式W=100-(G?X)/100計算，搗碎后靜置10～20min，加200mL丙酮并勻漿3min，加10g助濾劑(Celite)再勻漿10s。⑶.植物和動物油脂油脂溶液直接通過凈化步驟GPC凈化。2．分離用鋪有快速濾紙的布氏濾斗抽氣過濾(1)、(2)的提取液，直至收集濾液200mL以上，過濾時不要讓濾液中斷濾干。用刻度量筒量取200mL濾液移入500mL分液濾斗，加20g氯化鈉，用力振搖3min，再加100mL二氯甲烷，振搖2min，靜置約10min，使其分層，棄去下層水相，有機相加約25g硫酸鈉，靜置約30min，其間攪動幾次，然后通過出口塞上棉花裝3cm硫酸鈉的漏斗，用500mL圓底燒瓶收集濾液，用2×20mL乙酸乙酯分別潤洗分液漏斗和硫酸鈉2次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮溶液至2mL，用N2緩慢吹去最后一點痕量溶劑。3．凈化⑴.GPC凈化①.制柱:溶解上述濃縮瓶中殘留物，在裝有Bio-BeadsS-X3的GPC柱上凈化。(GPC柱為25mm內(nèi)徑，40cm長，大約50克Bio-Beads在洗提混合液中浸漬過夜，將懸浮液一次倒入柱中(容量約180mL)，一旦凝膠沉降到約32cm(沒有氣泡)，塞上活塞，壓低凝膠面，旋轉(zhuǎn)活塞到位。如果操作一段時間后，凝膠面還有下降，相應調(diào)節(jié)活塞。②.確定淋洗體積:一根新GPC柱使用前，必須用適當?shù)拇痔嵋杭皫追N待分析物質(zhì)測定淋洗條件，以確定其最佳淋洗體積。在實驗操作中，裝上加有標準品或粗提物質(zhì)混合液的樣品環(huán)，按照下面③方法進行淋洗，通過適當?shù)臋z測方法，測定添加物質(zhì)是否全部回收、是否有雜質(zhì)影響。在柱子長時間使用后，也要進行同樣的測定。③.粗提液的凈化:向粗提液濃縮后的殘留物中準確加入7.5mL乙酸乙酯，輕輕攪拌使其溶解，接著加入2g硫酸鈉，搖勻，再加入7.5mL環(huán)已烷，振蕩20s，用快速濾紙過濾后，將其加入到GPC柱子的樣品環(huán)中。凈化脂肪時，首先將5.0g脂肪溶解在淋洗液中，再用淋洗液定容至25.0mL，取一定體積的溶液移入樣品環(huán)。以5.0mL/min的流速用淋洗混和液淋洗GPC柱。對于多殘留分析，設置如下：棄去閥，開啟20min，棄去100mL收集閥，開啟13min，收集65mL潤洗閥，開啟2min，用10mL潤洗。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(慢慢旋轉(zhuǎn)，僅使?jié)饪s瓶少部分浸入水浴)將收集的淋洗液濃縮至約1mL，用移液管移入具塞刻度試管，用乙酸乙酯潤洗濃縮瓶，定容至5.0mL。濃縮適當流份的洗提液，用乙酸乙酯定容5mL，為了保證殘留農(nóng)藥的完全溶解，加乙酸乙酯定容是絕不可省略的。⑵.硅膠G微柱層析補充凈化①.制柱在層析柱按以下順序裝柱：玻璃棉栓，1.0g脫活的硅膠G，5～10mm無水硫酸鈉，玻璃棉栓。使用前，用5mL己烷沖洗柱子，棄去淋洗液，等己烷流到硅膠G層頂，加同樣溶液。②.淋洗液淋洗液1：正己烷/甲苯（65∶35,v/v）；淋洗液2：甲苯；淋洗液3：甲苯/丙酮（95∶5,v/v）；淋洗液4：甲苯/丙酮（80∶20,v/v）；淋洗液5：丙酮。③.硅膠G分離效率檢查在以上預洗的柱子上加1.0mL含0.05μg六六六，0.10μg林丹，0.20μg環(huán)氧七氯，0.25μgα-硫丹，0.25μg異狄氏劑，1.25μg硫丹硫酸酯/mL己烷。如果硅膠G的活性調(diào)節(jié)得正確，添加的化合物就應該存在于以下流份：淋洗液1：六六六(100%)、林丹(100%)、環(huán)氧七氯(部分量)、α-硫丹(部分量)淋洗液2：環(huán)氧七氯(剩余量)、α-硫丹(剩余量)、硫丹硫酸酯(95-100%)、狄氏劑(100%)④.收集樣品的不同洗提液從(1)凈化液中移取2.5mL于長頸圓底燒瓶，加5mL異辛烷，小心在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至1mL(不要蒸干)(慢慢轉(zhuǎn)動，將燒杯只浸在水浴上很少一點)。如果溶液聞起來還有乙酸乙酯味，再加異辛烷重復濃縮。將蒸發(fā)后的剩余溶液移到預洗過的硅膠G柱上，用大約1mL的己烷淋洗，然后用2mL淋洗液1潤洗圓底燒瓶，一旦己烷流到柱子頂部，就將潤洗液加到柱上；用刻度試管組成的接收器收集洗提液，然后再加6mL淋洗液1洗提，用淋洗液1將接收管定容10mL，產(chǎn)生的溶液代表洗提液1號。再用2mL甲苯(淋洗液2)潤洗圓底燒瓶，將潤洗液加到柱子上，用第2支刻度試管接收淋洗液，用6mL甲苯淋洗，接收的淋洗液用甲苯定容10mL得到2號洗提液。繼續(xù)以同樣方式，用淋洗液3、淋洗液4和丙酮(淋洗液5)連續(xù)洗提，每次均用2mL潤洗燒瓶，加6mL洗提，洗提液定容至10mL而得到洗提液3號、4號、5號。表8-1為不同洗提液中殘留農(nóng)藥的分布。表8-1硅膠G柱層析洗提液中的殘留農(nóng)藥分布化合物洗提液1洗提液2洗提液3洗提液4洗提液5有機氯化合物艾氏劑++++毒殺芬++++α-氯丹++++γ-氯丹++++殺螨酯(+)+++o,p’-DDD++++p,p’-DDD++++o,p’-DDE++++p,p’-DDE++++o,p’-DDT++++p,p’-DDT++++三氯殺螨醇++++狄氏劑-++++α-硫丹++++(續(xù)表)化合物洗提液1洗提液2洗提液3洗提液4洗提液5β-硫丹-++++硫丹硫酸酯-++++異狄氏劑-++++除螨酯-++++七氯++++環(huán)氧七氯+++++六氯苯++++α-六六六++++β-六六六++++γ-六六六++++δ-六六六++++異艾氏劑++++甲氧滴滴涕-++++Oxychlordane++++(+)多氯聯(lián)苯++++五氯硝基苯++++四氯硝基苯++++三氯殺螨砜-++++殺螨好++++有機磷化合物乙基谷硫磷--++++--溴硫磷++++乙基溴硫磷++++(+)三硫磷-++毒蟲畏--+++++-毒死蜱++++二嗪農(nóng)--++++--百治磷++++甲氟磷++++樂果+++++乙拌磷砜--++++--乙拌磷亞砜++++滅菌磷--+++--乙硫磷-++++皮蠅磷++++殺螟松-+++安果--+++--碘硫磷++++馬拉氧磷+++-馬拉硫磷--+++--甲胺磷++++殺撲磷--+++--速滅磷++++-氧化樂果++++對氧磷+++-對硫磷-+++(+)--甲基對硫磷-+++(+)--伏殺磷--+++--定菌磷--++++--(續(xù)表)化合物洗提液1洗提液2洗提液3洗提液4洗提液5硫特普-++++--硫磷嗪-++++--三唑磷-+++(+)--其它化合物敵菌磷--++++--樂殺螨-++++雙苯三唑醇+++-敵菌丹克菌丹--++++--抑菌靈-++++--敵螨普-++++菌唑靈--++++-麥穗寧++++(+)烯菌靈+++(b)賽克津--++--五氯苯胺++++增效醚--+++(+)-殘殺威--++++-除蟲菊--++++(+)-吡咪唑菌(a)--++++--滅蟲菊-++++三唑酮--++++-唑菌醇++++氟樂靈++++烯菌酮-+++(+)--注：(a)避光(b)再用8mL丙酮可完全淋洗(+)低于10%+約10-30%++約30-60%+++約60-90%++++高于90%4．氣相色譜測定將洗提液1-5號在以下氣相色譜條件下分析：氣相色譜操作條件1色譜儀HP5750G色譜柱4mmid×1.2m玻柱，裝填1.5%OV-17+1.95%QF-1/ChromosorbW-HP，100～120目柱溫180℃進樣口溫度230℃檢測器堿火焰離子化檢測器(N-FID)330℃氣體流速氦載氣60ml/min氫氣30ml/min空氣200ml/min衰減10·32記錄儀1mV，紙速60cm/h進樣量5μL氣相色譜操作條件2色譜儀HP5710G色譜柱4mmid×1.8m玻柱，裝填3%OV-61+7.5%QF-1+3%XE-60/ChromosorbW-HP，100～120目柱溫225℃進樣口溫度250℃檢測器電子俘獲檢測器(63NiECD)，300℃載氣流速氬-甲烷，40ml/min衰減256記錄儀1mV，紙速75cm/h進樣量5μL氣相色譜操作條件3色譜儀H-P5750色譜柱4mmid×1.8m玻柱，裝填6.5%DC-200+0.01%Versamid900/GasChromQ，80～100目柱溫210℃進樣口溫度235℃檢測器火焰光度檢測器(FPD-P，526nm濾光片)，190℃氣體流速載氣，氦氣55mL/min氫氣，110mL/min空氣，150mL/min衰減4·10-3記錄儀1mV，紙速75cm/h進樣量5μL

8.3選擇性多殘留方法(SelectiveMRMs)8.3.1N-氨基甲酸酯類殺蟲劑多殘留分析方法(FDA-PAM法)1．方法原理與適用性氨基甲酸酯類殺蟲劑及其代謝物用甲醇提取，提取液經(jīng)液-液分配和活性炭/助濾劑Celite柱層析凈化，通過反相柱、柱后水解和衍生化，形成的衍生物用高效液相色譜熒光檢測器進行檢測。對于非氨基甲酸酯結構的其它農(nóng)藥殘留的檢測步驟可以適當改變。柱后水解和衍生化方法適用于非脂肪性食品或脂肪性食品中具有氨基甲酸酯結構的農(nóng)藥殘留的檢測。適用于該方法檢測的農(nóng)藥參見表8-2。不需要柱后水解和衍生化的方法適用于熒光農(nóng)藥殘留的檢測，參見表8-3。一些農(nóng)產(chǎn)品（如柑桔）的提取物中含有具有熒光的共提取物，會干擾殘留分析結果?？税偻诤扛叩臉悠罚ㄈ缧迈r水果與蔬菜）的定量限為0.01mg/kg；在干樣中的定量限約為0.02mg/kg。表8-2柱后水解和衍生化方法的回收率（用甲醇提取，液-液分配及活性炭/助濾劑柱凈化，帶有柱后衍生化的熒光檢測器的高效液相色譜檢測）化學物質(zhì)添加回收率相對保留時間50%FSD（ng）3-羥基克百威C0.60103-酮克百威V(67-110℅)0.8511涕滅威C0.8314砜滅威P(60-50℅)0.339氧涕滅威C0.409惡蟲威C1.0010丁叉威C0.7515丁酮威C1.067甲萘威C1.0010二氧威C0.6715仲丁威C1.4710異丙威C1.138甲硫威C1.2610氨磺酰滅蟲威C0.7911石硫合劑滅蟲威C0.6412速滅威C0.8510殺線威C0.4410猛殺威C1.3110殘殺威C0.988硫雙威P(40-60℅)0.9911滅除威C1.0610注：C，完全回收（＞80℅）；P，部分回收（50~80%）；S，少量回收（＜50℅）；V：變異大相對保留時間是以克百威在該條件下所測得的保留時間為1.00而計算的。表8-3不需要柱后水解和衍生化方法的回收率（用甲醇提取，液-液分配，活性炭/助濾劑柱凈化，帶有熒光檢測器的高效液相色譜檢測）化學物質(zhì)添加回收率相對保留時間50%FSD（ng）注釋甲萘威C1.063激發(fā)波長288，發(fā)射波長330克百威C1.0090激發(fā)波長288，發(fā)射波長330二氧威C0.67180激發(fā)波長265，發(fā)射波長294氟草隆V(60-100℅)1.0950激發(fā)波長288，發(fā)射波長330；低添加濃度下，由于基質(zhì)的干擾，添加回收率的變異較大。異丙威C1.13370激發(fā)波長264，發(fā)射波長292萘乙酰胺P(77℅)0.753激發(fā)波長288，發(fā)射波長330；另外再用100mL石油醚淋洗活性炭柱，可以達到完全回收。敵草胺C1.364激發(fā)波長288，發(fā)射波長330伏殺硫磷C1.7090激發(fā)波長288，發(fā)射波長330增效磷C1.745激發(fā)波長288，發(fā)射波長330殘殺威C0.9840激發(fā)波長274，發(fā)射波長330注：C，完全回收（＞80℅）；P，部分回收（50~80%）；S，少量回收（＜50℅）；V：變異大相對保留時間是以克百威在該條件下所測得的保留時間為1.00而計算的。2．標準溶液的配制用甲醇在容量瓶中溶解氨基甲酸酯類殺蟲劑的標準品，配制成濃度為1ug/mL的溶液，并置于冰箱保存。大多數(shù)氨基甲酸酯類標準品按該方法貯存可以在幾個月時間內(nèi)保持穩(wěn)定，但滅蟲威砜和亞砜即便按照規(guī)定的方法小心貯存，也分別會在數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)降解。3．提取⑴.高含水量(>75%)樣品在勻漿缸中加入150g切碎的高含水量樣品和300mL甲醇，用勻漿器將混合物中速（第7檔）勻漿30秒，接著全速勻漿60秒，用布氏漏斗將勻漿液抽濾，濾液收集于500mL抽濾瓶中，如果濾液開始沸騰則減小真空度。將相當于100g樣品的濾液轉(zhuǎn)移至2L圓底燒瓶中（相當于100g樣品的濾液體積=100g樣品中含水體積(mL)+甲醇體積(200mL)-損失體積(10mL)），在圓底燒瓶中加水使水的總體積達100mL。將星狀磁力攪拌子置于圓底燒瓶中。在2L圓底燒瓶接上250mL緩沖瓶，并開啟真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。使冷卻液（-15℃）水/乙二醇（1∶1）在蒸發(fā)器冷凝管中循環(huán)；接收瓶浸于-15℃冷卻浴中。通過調(diào)節(jié)針狀閥逐漸增大真空度，盡量避免起泡。當達到真空時，將濃縮瓶慢慢移入35℃水浴中，將提取液濃縮至75mL。圖8-1真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器⑵.低含水量（<75％）樣品通過減小樣品量可以從低含水量樣品中用相同量的溶劑有效地提取出殘留農(nóng)藥。步驟同方法⑴，區(qū)別在于用300mL甲醇從75g磨碎的低含水量樣品中提取，將相當于50g樣品的濾液轉(zhuǎn)移至2L圓底燒瓶中（相當于50g樣品的濾液體積=50g樣品中含水體積(mL)+甲醇體積(200mL)），后續(xù)步驟同方法⑴，注意在圓底燒瓶中加水使水的總體積達100mL。4．液-液分配將提取方法⑴或⑵所得到的提取液移至500mL分液漏斗中，加入15g氯化鈉，充分振搖，直至氯化鈉溶解。分別用25mL乙腈洗圓底燒瓶3次，并將每次洗出液倒入分液漏斗中，充分振搖分液漏斗30s，靜置5min。將水相移至250mL分液漏斗中，加入50mL乙腈，振搖20s，靜置分層，棄去水相。在500mL分液漏斗中加入25mL20％氯化鈉水溶液，振搖20s，靜置分層，并將水相移入250mL分液漏斗。將250mL分液漏斗振搖20s，靜置分層，棄去水相。在500mL分液漏斗中加入100mL石油醚，振搖20s，靜置分層，將乙腈相移至第2個500mL分液漏斗中。將250mL分液漏斗中的乙腈相移至第1個500mL分液漏斗中（有石油醚相），振搖20s，靜置分層，將乙腈相移至第2個500mL分液漏斗中。在第1個500mL分液漏斗中加入10mL乙腈，振搖，靜置分層，將乙腈相移至第2個500mL分液漏斗中，棄去石油醚相。在第2個500mL分液漏斗中加入50mL2％氯化鈉水溶液?；旌弦悍謩e用100，25和25mL二氯甲烷連續(xù)提取3次，每次振搖20秒（后兩次需輕輕振搖）。將下層二氯甲烷/乙腈相通過5cm高的無水硫酸鈉柱（內(nèi)徑22mm），用1L圓底燒瓶收集淋出液。在圓底燒瓶中放入星狀磁力攪拌子，在1L圓底燒瓶接上250mL緩沖瓶，開啟真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。使冷卻液（-15℃）水/乙二醇（1∶1）在蒸發(fā)器冷凝管中循環(huán)；接收瓶浸于-15℃冷卻浴中。通過調(diào)節(jié)針狀閥逐漸增大真空度，盡量避免起泡。當達到真空時，將濃縮瓶慢慢移入35℃水浴中，當濃縮液中有機溶劑蒸發(fā)完全后，立即將圓底燒瓶從蒸發(fā)器上取下，并在圓底燒瓶中加入10mL二氯甲烷。5．活性炭/Celite柱層析凈化在具抽真空側口的層析柱尾頂端塞上單孔5號橡皮塞，接上500mL圓底燒瓶，打開層析柱活塞，連結抽真空裝置。在層析柱中先后加入0.5g硅烷化Celite*和5g活性炭**/Celite混合物***，并使之填塞緊密。在吸附劑上面塞入1~2cm玻璃棉，用50mL25％甲苯/乙腈淋洗液預洗，當預洗液接近玻璃棉頂端0.5cm處關閉柱活塞，斷開真空裝置，棄去圓底燒瓶中的溶液，重新將其接上層析柱。將己制備好的10mL二氯甲烷提取液上柱，以5mL/min的速度淋洗。分別用10mL二氯甲烷和25mL淋洗液洗1L圓底燒瓶，并將洗出液分別上柱淋洗，當淋洗液接近玻璃棉頂端時加入下一溶液。加入100mL淋洗液，并以5mL/min的速度淋洗。當淋洗液接近玻璃棉頂端時關閉柱塞。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將500mL圓底燒瓶中的淋出液濃縮至干，并立即取下圓底燒瓶。在500mL圓底燒瓶中立即加入5mL甲醇，以溶解提取凈化后的殘留農(nóng)藥。對于高含水量樣品，需用每mL溶液含有相當于20g樣品的提取液上柱凈化；對于低含水量樣品，需用每mL相當于10g樣品的提取液上柱凈化*硅烷化助濾劑Celite545的制備用鹽酸/水（1∶1）在2L燒杯中將150g助濾劑Celete545調(diào)成漿狀，蓋上玻璃蓋，沸點下磁力攪拌子攪拌10min。冷卻，過濾，用蒸餾水洗至中性。先后用500mL甲醇和二氯甲烷洗Celite，并將其在通風櫥中自然晾干。將Celite轉(zhuǎn)移至1L具塞錐形瓶中。在120℃烘箱中加熱干燥過夜（打開瓶塞）后，置于干燥器冷卻。將錐形瓶置于通風櫥，準確吸取3mL二氯二甲基硅烷加入錐形瓶中，使之與Celite充分混合，室溫下保存4h。在瓶中加入500mL甲醇，搖勻，靜置15min。過濾硅烷化Celite，用異丙醇洗至中性。在通風櫥中將硅烷化Celite自然晾干，除去異丙醇。在105℃烘箱中將硅烷化Celite干燥2h，并在干燥器中冷卻。將其保存于具塞容器中。通過2個試驗測定Celite的硅烷化效果。一種方法是取大約1gCelite置于50mL水中，硅烷化Celite會漂?。涣硪环N方法是取1gCelite置于20mL用甲基紅飽和的甲苯中，硅烷化Celite會呈黃色。在上述兩種方法中，如果Celite顆粒下沉并且（或）在甲苯（甲基紅飽和）中呈粉紅色，則Celite中仍存在活性部位，需要重新進行硅烷化處理。**活性炭的純化用700mL鹽酸將100g活性炭NucharS-N調(diào)成漿狀，蓋上玻璃蓋，沸點下磁力攪拌子攪拌1h。加700mL水，沸點下再攪拌30min。冷卻，過濾，用水洗至中性，先用500mL甲醇然后用500mL二氯甲烷洗活性炭，在通風櫥中自然晾干。在120℃烘箱中干燥4h后，置于干燥器中冷卻，并將其保存于具塞容器中。***活性炭/Celite柱的活性測定按上述方法制備活性炭/Celite（1∶4，w/w）凈化柱；制備濃度為5ug/mL的不同氨基甲酸酯殺蟲劑（西維因、滅蟲威、滅蟲威亞砜、滅多威）的甲醇溶液。滅蟲威亞砜在溶液中易分解，混合標樣應在使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。分別吸取5mL上述溶液加入250mL圓底燒瓶和25mL容量瓶中，用甲醇將溶液定容至25mL，作為HPLC分析的標樣。按上述方法用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將圓底燒瓶中的標準樣品溶液蒸發(fā)至干。當最后痕量的甲醇被蒸發(fā)完全后，將圓底燒瓶從蒸發(fā)器上取下，用10mL二氯甲烷將氨基甲酸酯殘留物溶解。將圓底燒瓶中的二氯甲烷溶液過已制備好的吸附柱，并按上述方法淋洗。將淋出液濃縮至干，用甲醇溶解，定容至25mL。按測定方法測定氨基甲酸酯的量，并計算其回收率。如果回收率≥95%，則活性炭是達到要求的。6．測定（HPLC，柱后衍生化，熒光檢測）⑴.原理甲醇溶液中的農(nóng)藥殘留以乙腈/水為流動相，通過C-8反相HPLC柱，進行梯度洗脫分離。柱后淋出液中的農(nóng)藥殘留在堿性條件下被在線水解為甲胺化合物，該化合物與鄰-苯二醛和2-巰基乙醇在線反應，生成熒光基團，通過熒光檢測器檢測。這一柱后衍生化—熒光檢測的測定方法對于含有氨基甲酸酯結構的農(nóng)藥殘留具有很好的選擇性。⑵.儀器溶劑過濾裝置，具Luer-Lip頭的10mL注射器，配有(a)直徑13mm的Swinny不銹鋼過濾頭，直徑為13mm的5.0μmLS型過濾器或(b)直徑為13mm用聚丙烯固定的0.22μm尼龍濾膜。(也可選擇使用預裝好的無需注射器的裝置)。高效液相色譜儀包括下列組件（圖8-2）流動相傳輸系統(tǒng)，程序控制的HPLC梯度洗脫系統(tǒng)；進樣器，具有10μL進樣環(huán)的自動取樣器；不銹鋼保護柱，內(nèi)含25~37μm的C-8或C-18薄膜；柱溫箱或柱加熱器；分析柱，25cm×4.6mmid，填充6μmZorbaxC-8球形顆粒，柱填充物包括5或6μm由辛硅烷試劑鍵合形成的單分子球形結合物。連接管，編號為304的不銹鋼管（1.6mmod×0.18mmid）連接進樣器、柱與第一個T形管。柱后衍生反應裝置，該單元由下列組件構成：Teflon涂層的玻璃柱（60cm×25mmid）作為貯液器，柱內(nèi)存有氫氧化鈉和OPA-MERC反應溶液；通N2增加柱壓，并通過調(diào)節(jié)壓力大小控制合適的溶液流速。（可以用泵代替氮氣增壓）。Teflon限制管（6m×0.5mmid），其將每個貯液器與15cm×0.18mmid的不銹鋼管相連接，該不銹鋼管依次與0.74mmid的不銹鋼T形混合器（Valco儀器公司，編號為ZVT-062）相連，與流動相相通。氨基甲酸酯水解室，不銹鋼管（3m×0.48mmid，編號為321），繞有與小型烘箱相連的加熱管以維持水解室的溫度始終保持在100℃。反應管，25cm不銹鋼管，一端與T形混合器相連以輸送OPA-MERC溶液，另一端連結檢測器內(nèi)腔（1.5cm×0.3mmid）目前可以從一些廠家（ABI，PickeringInstruments,Waters等公司）購買商品化的柱后衍生反應裝置，以代替上述組件。該反應裝置最好配備雙泵。熒光檢測器，雙單色器，配有≤20uL的腔體。圖8-2圖8-2氨基甲酸酯類農(nóng)藥HPLC檢測系統(tǒng)⑶.測定方法一50％乙腈/水(HPLC級)作為流動相，控制流動相的流速為1.50±0.02mL/min?？刂?.05N氫氧化鈉溶液和OPA-MERC反應溶液*(試劑制備見下注)的流速分別為0.50±0.02mL/min。柱溫為35℃，水解室的溫度為100℃。熒光檢測器的激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。狹縫寬度分別為15和12nm。檢測器的光倍增管設為低值，時間常數(shù)為1s。調(diào)節(jié)檢測器靈敏度，使1.0ng克百威溶液的響應為記錄儀或積分儀量程的50±5%?；€噪音應該<2％，氨基甲酸酯類殺蟲劑應按照圖8-2的步驟洗脫。如果系統(tǒng)停用幾天，則用甲醇代替水移動相清洗系統(tǒng)。從貯液器中倒出氫氧化鈉和OPA-MERC反應溶液，并用水清洗貯液器和相連的管子后，再用甲醇清洗。當再次使用系統(tǒng)時，將流動相改為水(HPLC級)，在貯液器中加反應溶液前用水清洗貯液器和相連管子。過濾由凈化后所得到的圓底燒瓶中的甲醇提取液；將收集到的濾液（約4.5mL）置于10mL離心管或其它合適的容器中。因為樣品濃度己知（g樣品/mL甲醇），因此收集的濾液體積多少不是十分重要。如果溶液要求稀釋，則吸取一定量溶液至另一容量瓶定容至一定體積備用。取10μL甲醇溶液進樣。通過農(nóng)藥樣品在色譜圖上的保留時間來定性。通過將待測農(nóng)藥色譜峰的峰高或峰面積與己知量的標準樣品的峰高或峰面積相比較來測得未知農(nóng)藥殘留的含量。為了保證農(nóng)藥殘留量測定的可靠性，進待測樣品后立即進標樣，待測樣品色譜峰和標樣色譜峰應匹配在±25以內(nèi)。⑷.測定方法二用于不需要柱后水解和衍生化的熒光農(nóng)藥殘留檢測。HPLC系統(tǒng)的建立與操作同前所述，區(qū)別在于：水解室在室溫下操作；熒光檢測器的激發(fā)波長為288nm，發(fā)射波長為330nm。將氫氧化鈉溶液和OPA-MERC反應溶液加入流動相時，關閉泵或氮氣流。測定操作方法同測定方法一。*試劑制備乙腈，全玻璃蒸餾裝置重蒸。在使用前，進行脫氣處理（將乙腈置于玻璃瓶中，抽真空并用磁力攪拌子緩慢攪拌5min），經(jīng)過處理的乙腈優(yōu)于HPLC級，可以避免產(chǎn)生雜峰。2-巰基乙醇(MERC)，98+％甲醇，全玻璃蒸餾裝置重蒸鄰-苯二醛(OPA)，色譜級0.05M的硼酸鈉緩沖溶液：稱取19.1gACS級Na2B4O7·10H2O，用約500mL脫氣的HPLC級水在水浴中加熱溶解，室溫下冷卻，再用脫氣的HPLC級水定容至1L，輕輕地將溶液搖勻，盡量避免空氣進入溶液中。0.05N的氫氧化鈉溶液：按下述方法制備氫氧化鈉上清液，即取一份氫氧化鈉（碳酸鈉的含量<5％），用一份水溶解。塞緊蓋后靜置大約10天，直到碳酸鈉沉入下層。吸取27mL上部澄清的氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并用水定容，得到5N的氫氧化鈉溶液。吸取10mL5N濃度的氫氧化鈉溶液，加入1L容量瓶中，用脫氣的HPLC級水定容，輕輕地將溶液搖勻，盡量避免空氣進入溶液中。水，HPLC級，商品純水或用純化水裝置制備的蒸餾水或去離子水，用于HPLC時，按乙腈脫氣的相同方法進行脫氣。水必須盡量純化以防止堵塞HPLC柱或出現(xiàn)異常峰形。用于HPLC的水必須是HPLC級的(不特別指明為HPLC級的水是指蒸餾水)。OPA-MERC反應溶液，稱取500mgOPA加入1L容量瓶中，用10mL甲醇溶解，加入500mL0.05M硼酸鈉緩沖液和1mL2-巰基乙醇。用硼酸鈉緩沖液定容，輕輕地將溶液搖勻，盡量避免空氣進入溶液中。（從市場購得的塑料瓶中的硼酸鹽溶液或者低純度的OPA會造成熒光背景過高）。制備的溶液可以在室溫下保存2天，在冰箱或在氦氣保護下可以貯存1周左右。8.3.2苯脲類除草劑多殘留分析（FDA-PAM法）1．方法原理與適用性苯脲類除草劑用甲醇提取,提取液采用液-液分配和弗羅里硅土柱層析凈化。殘留物采用反相柱，柱后光解、衍生化，衍生物經(jīng)HPLC熒光檢測器檢測。本方法可用于14種非脂肪性樣品中至少14種苯脲類除草劑在0.05,0,5和1.0mg/kg水平的殘留分析。2．標準溶液配制每種標準品用HPLC級異丙醇配制貯備溶液（1mg/mL）。取適量的每種貯備標準溶液混合，用乙腈/水（HPLC級）（1:1）稀釋成工作標樣。用1.25μg/mL的標樣進行HPLC檢測。貯備溶液保存在冰箱中，每周重新配制工作標樣。3．提取稱取50g樣品，加入離心瓶中，加100mL甲醇，用Polytron勻漿儀，速度8檔，勻漿1.5min。勻漿液在1500rpm離心5min，傾出80-100mL上清液，用玻璃棉過濾，250mL量筒接收。向離心瓶中加100mL甲醇，8檔勻漿1min。離心，上清液用玻璃棉過濾，全部轉(zhuǎn)入上面的250mL量筒。記錄全部甲醇提取液體積。4．液液分配將甲醇提取液全部轉(zhuǎn)入500mL分液漏斗。加30mL飽和氯化鈉溶液，50mL正己烷，振搖30s，靜置分層。下層水相轉(zhuǎn)入1L分液漏斗中，分液漏斗中先加500mL水，30mL飽和氯化鈉溶液。棄去己烷相。向1L分液漏斗中加200mL二氯甲烷，振搖1min。二氯甲烷相經(jīng)25mm×50mm無水硫酸鈉柱脫水，轉(zhuǎn)入裝好的具5mL刻度接收瓶的500mLK-D濃縮器中。水相用100mL二氯甲烷提取2次，脫水后一并轉(zhuǎn)入K-D濃縮器。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉柱，淋洗液一并轉(zhuǎn)入K-D濃縮器。在K-D濃縮器中加入沸石，濃縮至約3mL，轉(zhuǎn)入弗羅里硅土柱凈化。5．弗羅里硅土柱凈化稱取4g活化的弗羅里硅土，裝入10mmid層析柱，上面加1cm硫酸鈉，用30mL二氯甲烷預淋，棄去淋洗液。當二氯甲烷層接近硫酸鈉層頂部時，將具5mL刻度接收瓶的250mLK-D濃縮器置于層析柱下。將濃縮的提取液轉(zhuǎn)入層析柱，容器用約3mL二氯甲烷潤洗，潤洗液轉(zhuǎn)入層析柱。當提取液接近硫酸鈉層頂部時，用3mL二氯甲烷淋洗層析柱2次，使每次的淋洗液均接近硫酸鈉層頂部。最后一次潤洗液接近硫酸鈉層頂部時，用50mL20%丙酮/二氯甲烷淋洗層析柱。淋洗液在蒸汽浴上濃縮至約3mL，移去接收瓶，40℃水浴用N2濃縮至干。移取2mL乙腈/水(HPLC級)(1+1)，加入接收瓶中。按下式計算最終凈化的提取液相應的樣品量。6．測定（HPLC，柱后光解、衍生，熒光檢測）⑴.原理乙腈/水中的殘留物以甲醇/水為流動相，經(jīng)C-18反相柱梯度洗脫、分離，柱中洗脫的殘留物（流出物經(jīng)過Teflon套管以增加在紫外光下的暴露）在線光解為胺，胺在線與鄰一苯二醛及2-巰基乙醇反應生成熒光基團，通過熒光檢測器檢測。本法對苯脲類除草劑有極強選擇性。⑵.儀器溶劑過濾裝置，具Luer-Lip頭的10mL注射器，配備直徑13mm的Sueling不銹鋼過濾頭，直徑13mm的5μmLS型濾器或直徑13mm用聚丙烯固定的0.2μm尼龍濾膜。(也可用無需注射器的預裝好的裝置)。符合下述要求的高效液相色譜儀，包括：流動相傳輸系統(tǒng)，雙泵梯度洗脫系統(tǒng)；具40μL定量環(huán)的進樣器；保護柱，直接與預填充的C-18柱連接；柱溫箱或柱加熱器，保持柱恒溫；分析柱，25cm×4.6mmid，填充十八碳硅烷鍵合的粒狀顆粒(ODS，C-18)，如EconosphereC-18；圖8-3所示的柱后光解、衍生單元，包括：用于光解的紫外燈，配備電源，17cm×9mmod；Teflon光解燈套管，25’×0.5mmid線圈，將Teflon管盤繞在燈上，一端與T形混合器相連，另一端與柱連接；用于OPA-MERC溶液的低流速泵，連接錐形線圈，在泵和0.5mmidTeflon管間作為脈沖阻尼器，與T形混合器相連；T形混合器，不銹鋼，0.25mm孔徑,標準1/16”；反應線圈，10’×0.5mm延遲線圈，一端與T形混合器相連，另一端連結檢測器；熒光檢測器。⑶.測定條件圖8-3苯脲類除草劑HPLC檢測系統(tǒng)用單泵或雙泵，以0.002MNaH2PO圖8-3苯脲類除草劑HPLC檢測系統(tǒng)保持分析柱溫35℃，用40%甲醇/水，1mL/min平衡系統(tǒng)，OPA-MERC溶液以0.2mL/min加入T形混合器，OPA-MERC溶液開始流動時，打開紫外燈，穩(wěn)定檢測器。進檢測溶液或標準溶液后，從40%甲醇/水到80%甲醇/水開始30min的線性梯度洗脫，檢測器激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。調(diào)節(jié)檢測器靈敏度，使1.0μg/mL敵草隆溶液40μL的響應為記錄儀或積分儀量程的50%。此條件下敵草隆的洗脫時間約為24min。每天使用后，用80%甲醇/水沖洗柱子20min，色譜柱也可在此重要條件下貯存。8.3.3苯并咪唑類殺菌劑的多殘留分析（FDA-PAM法）1．方法原理與適用性用甲醇提取，提取液酸化后，通過液液分配法轉(zhuǎn)移到二氯甲烷中，然后將提取液堿化。分離殘留，并用配有紫外和熒光檢測器的反相離子對高效液相色譜法進行定量分析。該方法適于蔬菜和水果中脲基甲酸鹽、多菌靈（由于使用苯菌靈、多菌靈或甲基硫菌靈而得）和涕必靈的殘留測定。紫外檢測器對適用該方法的所有的殘留農(nóng)藥都有響應，而熒光檢測器僅對多菌靈和涕必靈有響應。采用已給的方法分析樣品中的殘留會將樣品中的干擾物質(zhì)與殘留農(nóng)藥一并提取出來。將此方法變動以適用于咖啡豆的分析，但僅限于對多菌靈的分析。該方法對于所測定的各種農(nóng)藥的定量限都是0.1mg/L。紫外檢測器是非選擇性的，易受作物的干擾，因此定量限可能受某種樣品的影響。對于涕必靈，使用熒光檢測器，在最大吸收波長條件下，該化合物的定量限可增至0.01mg/L。2．標準溶液配制分別用丙酮配制25μg/mL的脲基甲酸鹽、多菌靈、涕必靈和甲基托布津的儲備液（不用苯菌靈配制儲備液，是因為該溶液靜置過夜時，完全降解為多菌靈）。標準品溶液在丙酮和HPLC流動相中穩(wěn)定?；鞓说呐渲疲簭囊雅浜玫膬湟褐?，各取出1mL混合后，在30~40℃的微熱下、以氮氣流揮發(fā)溶劑至干，然后加入4.0mL甲醇溶解，再加入6.0LHPLC離子對溶液，混勻，得各種標準品的最終濃度均為2.5μg/mL。3．提取稱取50g已切碎的樣品于500mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇，在機械振蕩器上振蕩10min。如分析香蕉（整個或僅果肉部分），則在機械振蕩器上振蕩之前，先用手用力將其搖勻。用裝有濾紙的布氏漏斗將上述溶液過濾至真空濾瓶中,然后用50mL甲醇沖洗錐形瓶和濾紙上的殘渣。轉(zhuǎn)移濾液于500mL分液漏斗中，加10mL1M鹽酸和100mL1%NaCl溶液?；靹?，冷卻。每次用100mL二氯甲烷劇烈振蕩提取濾液兩次，每次提取1min。將二氯甲烷層過約70g的無水硫酸鈉柱（脫水），用圓底燒瓶收集柱流出液。甲醇水溶液層仍保存在分液漏斗中，留待以后提取用。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉柱，并收集在圓底燒瓶中。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在≤30℃的水浴中，揮發(fā)圓底燒瓶中的二氯甲烷，至干。加入4mL甲醇溶解提取物，該提取物中含有脲基甲酸鹽、甲基硫菌靈、涕必靈和一些多菌靈。將分液漏斗中的甲醇水溶液層全部轉(zhuǎn)移到燒杯中，用2×10mL水沖洗分液漏斗兩次，洗液倒入燒杯中。用5M和1M的NaOH（如需要，可用1M鹽酸）調(diào)節(jié)燒杯中提取液的pH至7.5~8之間。在調(diào)節(jié)溶液的pH值時，切勿使溶液呈強堿性。再將燒杯中溶液倒入分液漏斗中，用2×100mL二氯甲烷激烈振蕩提取兩次，每次提取1min。將二氯甲烷層過約70g的無水硫酸鈉柱，用圓底燒瓶接收柱淋出液（前面用于干燥二氯甲烷的無水硫酸鈉柱可再次使用）。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉，并收集在圓底燒瓶中。在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，揮發(fā)二氯甲烷提取液至干，用4mL甲醇溶解提取物。至此，已將大部分的多菌靈和涕必靈提取出。4．凈化本方法目前沒有可以參考的凈化方法5．測定⑴.原理苯并咪唑類殺菌劑的殘留采用離子對反相色譜進行分析。多菌靈和涕必靈在酸性流動相中被離子化與由癸烷基磺酸鈉產(chǎn)生的帶負電荷的反離子形成離子對，以控制HPLC系統(tǒng)的選擇性，并從樣品提取物中的干擾物中分離出待分析物。根據(jù)反相色譜的原理，在該條件下的柱中呈中性的甲基脲酸鹽和甲基硫菌靈將不受流動相改變的影響。紫外和熒光檢測器均對多菌靈和涕必靈有響應，紫外檢測器還對甲基硫菌靈和脲基甲酸鹽響應。⑵.儀器流動相輸送系統(tǒng)，恒流泵。進樣器，帶有≥25μL定量環(huán)的自動樣品進樣閥。色譜柱，25cm×4.6㎜i.d，與硅鍵合的C18柱，粒徑5μm，適于大多數(shù)堿性化合物的分析。與色譜柱配套的保護柱，與硅鍵合C-18柱的填料相同。柱溫箱，可容納保護柱和色譜柱?？勺儾ㄩL紫外檢測器或二極管陣列檢測器，且裝有約8μL的流通池。記錄儀，譜線記錄儀或適于各種檢測的計算積分儀。⑶.測定條件流動相：離子對溶液和甲醇以65：35的比例混合的混合液（切勿用泵混合流動相，因為混合時的放熱反應所產(chǎn)生的氣泡使泵不能穩(wěn)定地工作）。在使用前，要邊用磁力攪拌子劇烈攪動溶液，邊通入氦氣進行脫氣。離子對溶液，4.1mMl-癸烷磺酸鈉鹽（純度為98%），移取7.0mL磷酸（85%）于200mLHPLC純的水中，在該溶液中加1.0gl-癸烷磺酸鈉鹽。再移取10.0mL三乙胺（99%）于溶液中，并用HPLC純的水稀釋至1L。過＜1μm的微孔濾膜（溶液的pH值應約為2.4）。甲醇，全玻璃蒸餾器蒸餾HPLC純的水，市售或采用制備蒸餾水、去離子水的純水裝置制得。該水的電阻值務必＞12.cm。將熒光檢測器與紫外檢測器串聯(lián)在一起設柱溫箱溫度為40℃，用流動相以1.5mL/min的流速平衡系統(tǒng)30min以上或直到所得4個分析物的保留時間是一個常量。如長時間（≥24h）不用，則用50%的甲醇/水溶液洗柱；如短期內(nèi)不用，則用低流速（0.10~0.2mL/min）的流動相清洗柱子以防止鹽沉積。為了去除柱中殘留量高的樣品組分，在50%的甲醇/水溶液洗柱后，用甲醇洗柱。在輸入流動相之前，再用50%的甲醇/水溶液洗柱。加入甲醇前，必須用水沖洗柱中的流動相，反之亦然以避免鹽沉積可能會堵塞系統(tǒng)。紫外檢測器吸收波長開始設為250nm，在淋洗完脲基甲酸鹽后，將波長設為280nm，并將基線調(diào)至零起始線測定甲基硫菌靈、多菌靈和涕必靈。調(diào)整檢測器和/或記錄儀的靈敏度，使每一標準品（62.5ng/25μL）響應均為滿刻度的40-70%。熒光檢測器的激發(fā)波長設為280nm（狹縫寬為20nm），發(fā)射波長設為310nm（狹縫寬為10nm）。調(diào)整檢測器、衰減和/或記錄儀的靈敏度，使62.5ng/25μL的MBC響應為滿刻度的60~80%，而在此條件下，62.5ng涕必靈的響應則為滿刻度的40~50%。另外，還可使用可程序改變波長熒光檢測器和可程序改變波長或二極管陣列紫外檢測器，以在最佳波長條件下進行殘留測定。8.4農(nóng)藥多殘留分析的確證在進行農(nóng)藥多殘留分析時，尤其檢測未知樣品時，必須對檢測到的農(nóng)藥殘留進行確證。例如，利用色譜方法檢測時，對應某標準化合物保留時間有一樣品峰，此時不能簡單地認為這個樣品峰和標準化合物是同一物質(zhì)，而必須確定此樣品峰不是雜質(zhì)引起的測定干擾峰，因此未知樣品的分析中，檢出成分的定性分析就顯得非常重要。樣品提取液中分析物的合理定性是非常重要的。在很多情況下，由于樣品中存在一些共提物，而這些共提物的性質(zhì)與待測目標又很相似，因而在測定時表現(xiàn)出與待測目標物相似的特性，此時如果不加以分析辨別，就會引起假陽性。這里對常用的確證方法進行介紹。8.4.1農(nóng)藥確證的定義按照IUPAC推薦的定義，所謂農(nóng)藥確證(pesticideidentification)是指在試驗條件或分析條件下，對某農(nóng)藥或代謝降解物的化學特征進行明確檢測的過程。因此，確證方法應盡可能提供有關分析物結構方面的信息。如果某一方法不能提供結構信息，或缺乏足夠的特異性，結果就希望能通過一定的分析步驟如凈化、色譜分離和色譜檢測等來實現(xiàn)。農(nóng)藥確證分初步確證（tentativeidentification）和一致性確證(confirmationofidentity)。初步確證是指利用分析物和標準品相比較而進行的確證，如方法的回收率、保留時間（相對保留時間）、選擇性檢測器上的響應等。這種確證在已知物分析中應用很多。但這種簡單確證很容易受樣品的重要性、本身特性、殘留水平、樣品歷史、分析目的以及分析樣品的數(shù)目、時間、費用等影響，有時并不能真正反映檢測的結果，尤其是當樣品中干擾物很多，且待測物含量很低時，很容易出現(xiàn)誤檢或漏檢，這時就需要進一步的確證，即一致性確證。農(nóng)藥確證又可分定性確證和定量確證。定性確證是利用檢測對象不同的理化性質(zhì)來進行對比，以證實某化合物的